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Agarose-Gelelektrophorese



Agarose-Gelelektrophorese ist eine molekularbiologische Methode, um Nukleinsäure-Stränge (RNA oder DNA) nach ihrer Größe zu trennen und um ihre Größe durch Vergleich mit Strängen bekannter Größe zu bestimmen. Lange Fäden aus Agarosepolymeren werden zu einem Gel vernetzt. Je höher die Agarose konzentriert ist, desto kleiner sind die Poren, die sich in dem Gel befinden. Die Gelelektrophorese funktioniert wie ein Sieb für Moleküle; ein elektrisches Feld wird verwendet, um die negativ geladenen Nukleinsäure-Moleküle durch die Gelmatrix zu ziehen, wobei die kleineren Moleküle sich schneller durch das Gel bewegen können und somit eine Auftrennung der Stränge nach ihrer Größe ermöglicht wird.

Inhaltsverzeichnis

Material

Für die Agarose-Gelelektrophorese werden benötigt:

  • Die DNA, die nach ihrer Größe aufzutrennen ist.
  • Eine DNA-Leiter, eine Mischung verschiedener DNA-Stränge bekannter Länge, mit der die DNA-Probe verglichen werden kann, um deren Größe zu bestimmen. DNA-Leitern sind kommerziell erhältlich.
  • TBE-Puffer, pH 8,0
  • Agarose
  • Ethidiumbromid (5 mg/ml in Wasser) oder anderer Nukleinsäure-Farbstoff
  • Ein Farbmarker, z. B. ein niedermolekularer Farbstoff wie Bromphenolblau, um den Fortschritt der Elektrophorese abschätzen zu können.
  • Eine Elektrophoresekammer aus Plexiglas.
  • Ein "Kamm" (normalerweise aus Plexiglas oder Teflon).

Vorbereitung

  1. Herstellung einer 1% Agaroselösung in TBE; für kleine DNA-Fragmente bis zu 2%. Volumen 15-100 ml, je nach Größe des Gels.
  2. Agaroselösung aufkochen bis die Agarose gelöst ist, normalerweise im Mikrowellenherd.
  3. Die Lösung bei Raumtemperatur bis auf ca. 60 °C abkühlen lassen.
  4. 1 µl Ethidiumbromid pro 10 ml Gellösung dazugeben. Vorsicht: Ethidiumbromid ist mutagen!
  5. Die Gellösung mischen, bis sich das Ethidiumbromid gut verteilt hat, dann in die Gelkammer gießen.
  6. Den Kamm auf einer Seite des Gels hineinstecken, ca. 5-10 mm vom oberen Rand entfernt.
  7. Wenn das Gel fest geworden ist, den Kamm entfernen. Die Aussparungen, die im Gel zurückbleiben, werden als Taschen bezeichnet, diese sind vor Auftragen der Probe mit Puffer zu spülen.
  8. Das Gel in TBE-Laufpuffer legen. Das Gel muss vollständig bedeckt sein. Die Taschen müssen an der negativen Elektrode der Kammer zu liegen kommen.
  9. Den Probenpuffer mit Farbmarker zu den DNA-Proben hinzugeben. Die DNA-Leiter enthält für gewöhnlich schon Farbmarker.

Prozedur

  1. DNA-Leiter und -Proben mit einer Pipette in jeweils eine Tasche spritzen (je nach Größe der Taschen von 2 µl bis zu 100 µl).
  2. Konstante Elektrische Spannung nach Länge der Elektrophoresekammer anlegen (5 Volt/cm); d.h. bei 20 cm Länge eine Spannung von 100 V.
  3. Elektrophorese beenden, wenn die DNA-Fragmente genügend aufgetrennt sind (anhand der Farbfront abschätzen).


     

  1. Das Agarosegel mit 3 Taschen (S).
  2. Einspritzen von DNA-Leiter in die erste Tasche.
  3. DNA-Leiter ist aufgetragen. Proben 2 und 3 werden aufgetragen.
  4. Eine Spannung wird angelegt. Die DNA wandert zur positiv geladenen Anode, weil sie negativ geladen ist (Phosphatreste im "Rückgrat" der DNA).
  5. Kleine DNA-Fragmente wandern schnell, große langsam durch das Gel. Die DNA ist währenddessen normalerweise nicht sichtbar. Daher wird der Fortschritt an der Farbfront abgelesen, die sich mit einem DNA-Fragmente bestimmter Länge auf gleicher Höhe durch das Gel bewegt (je nach Farbstoff und Agarose-Konzentration unterschiedlich).
  6. Anhand der Farbfront wird abgeschätzt, wann die Elektrophorese beendet und ausgewertet wird.

Das Gel kann unter einer UV-Lampe betrachtet werden. Ethidiumbromid, das sich in die DNA eingelagert hat, fluoresziert im ultravioletten Licht (Gesichtsschutz tragen!). Eine DNA-Bande kann aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA zur weiteren Verwendung aus dem Gel aufgereinigt werden.

Siehe auch

Literatur

  • Simple Protocol for Secondary School Hands-on Activity: Electrophoresis of pre-stained Nucleic acids on agar-agar borate gels. PDF
  • Adkins, S. and Burmeister, M. (1996). Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: applications for preparative gels and educational demonstrations. Anal. Biochem. 240, 17-23. PMID 8811874
 
Dieser Artikel basiert auf dem Artikel Agarose-Gelelektrophorese aus der freien Enzyklopädie Wikipedia und steht unter der GNU-Lizenz für freie Dokumentation. In der Wikipedia ist eine Liste der Autoren verfügbar.
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