miniDAWN TREOS und Optilab T-rEX - das Dream Team für die absolute Charakterisierung von Proteinen und Polymeren

Der miniDAWN TREOS^® Streulichtdetektor von Wyatt Technology ist ein 3-Winkel MALS Lichtstreudetektor der neuesten Generation und ermöglicht die Messung von absoluten Molmassen, Radien und zweiten Virialkoeffizienten. Dabei kann der miniDAWN TREOS^® Streulichtdetektor sowohl gekoppelt an die Chromatographie (GPC/SEC) als auch im „Stand Alone“-Modus, also für Batch-Messungen, eingesetzt werden.

Mit MALS (Mehrwinkellichtstreuung, Multi Angle Light Scattering), oft auch als klassische oder statische Lichtstreuung bezeichnet, werden Molmasse bzw. Molekulargewicht von Makromolekülen aufgrund der Menge des von ihnen gestreuten Lichtes gemessen. Der miniDAWN TREOS^® Streulichtdetektor ermöglicht dabei aufgrund der verwendeten MALS Technologie die Bestimmung der Streulichtmenge beim Streuwinkel 0°, also genau in Richtung des Primärlichtes. Daher kann man mit dem miniDAWN TREOS^® absolute Messungen durchführen, ohne auf Annahmen über die Eigenschaften der Moleküle oder auf Molmassenstandards angewiesen zu sein. Wyatt Streulichtdetektoren sind die einzigen, die diese Voraussetzungen für absolute Messungen erfüllen.

Des Weiteren bietet der miniDAWN TREOS^® Streulichtdetektor die beste Sensitivität bei gleichzeitig größtem Messbereich. Dies wird durch die Verwendung modernster Technologie mit geregeltem Laser, speziell hergestellten Hybrid Photodioden mit integrierten Transimpedanz-FET-Verstärkern, 24-bit Detektorauflösung und Ethernet Kommunikation erreicht. Es  können kleinste Molmassen von bis zu 500 g/mol bis hin zu hochkonzentrierten 200 mg/mL Lösungen gemessen werden.

Diese Leistungsfähigkeit ist das Ergebnis einer kontinuierlichen Weiterentwicklung in den vergangenen 30 Jahren und spiegelt die Kompetenz von Wyatt Technology auf dem Gebiet der makromolekularen Charakterisierung wider. Sie ist darüber hinaus in Tausenden von wissenschaftlichen Publikationen dokumentiert, die in der Wyatt Technology Literaturdatenbank (Internet) recherchiert werden können. Hier kann man schnell und einfach nach Anwendungen und Schlüsselbegriffen suchen und entsprechende Informationen für die individuelle Fragestellung beschaffen.

Der miniDAWN TREOS^® Streulichtdetektor ist nicht nur das leistungsfähigste Gerät seiner Klasse, er ist auch besonders robust. Die Flusszelle aus Quarzglas kann mit allen organischen und wässrigen Lösungsmitteln benutzt werden. Sie lässt sich vom Anwender leicht auseinanderbauen und reinigen. Alternativ kann man auch das integrierbare Zellreinigungssystems COMET softwaregesteuert einsetzen, das die Zelle mittels Ultraschall automatisch säubert. Die Kalibrierung ist für alle Lösungsmittel gültig. Besonders anwenderfreundlich: diese Einstellung muss nur alle 12 Monate überprüft werden.

Der ideale Partner für den miniDAWN TREOS^® Streulichtdetektor ist das Optilab^® T-rEX,  das mittels Messung des Brechungsindex die Konzentrationsbestimmung vornimmt. Durch die Verwendung eines Detektorarrays mit 512 Dioden anstelle der herkömmlichen 2 Dioden wurden in diesem Instrument Arbeitsbereich und Sensitivität auf für RI Detektoren bisher nicht erreichbare Werte optimiert. Sein dynamischer Bereich ist 50-mal höher als bei konventionellen RI-Detektoren. Es gibt keine Einstellung des Messbereiches oder Verstärkungsfaktoren. Vielmehr steht die volle Sensitivität über den gesamten Messbereich zur Verfügung. Das Optilab^® T-rEX gewann mehrere Auszeichnungen und besitzt gegenüber seinem Vorgänger, dem Optilab^® rEX, eine dreimal höhere Sensitivität. Erreicht wurde dies durch eine verbesserte Temperierung und eine leistungsstärkere Lichtquelle.

Neben der differentiellen Messung kann das Optilab^® T-rEX auch den absoluten Brechungsindex messen, obwohl es sich um ein Ablenkungsrefraktometer handelt. Ein Austausch der LED zur Änderung der Wellenlänge lässt sich vom Benutzer leicht in Eigenregie durchführen. Dies ermöglicht Messungen bei verschiedenen Wellenlängen. Das Optilab^® T-rEX kann im Temperaturbereich von 4°C bis 50°C betrieben werden, ein luftgekühltes Peltierelement sorgt für wartungsfreie Temperierung ohne externe Hilfsmittel.

miniDAWN TREOS^® Spezifikationen

• Absolute Molmassen ab 500 g/mol
• 50 mW Laser mit 658 nm Wellenlänge
• Laser Leistung justierbar
• 20 nL Streuvolumen
• Flusszelle aus Quarzglas
• DLS Option verfügbar
• COMET Option verfügbar
• Ethernet Schnittstelle
• Gas- und Leck-Detektoren
• 6,4“ 16-bit Color hoch auflösende Anzeige

Optilab^® T-rEX Spezifikationen

• Arbeitsbereich -0.0047 bis +0.0047 RIU
• Peak-to-Peak Rauschen 7,5E-10 RIU
• 512 Dioden Detektor Array
• Lichtquelle LED, verschiedene Wellenlängen
• automatische Optimierung der LED
• Brechungsindex Messung
• Peltier Heizung / Kühlung
• Ethernet Schnittstelle
• Gas- und Leck-Detektoren
• 6,4“ 16-bit Color hoch auflösende Anzeige

Integration in HPLC Systeme:
Der TREOS^® Streulichtdetektor lässt sich problemlos in alle chromatographische Systeme integrieren. Sehr häufig wird SEC/GPC (Größenausschluss Chromatographie / Gel Permeations Chromatographie) verwendet, aber auch Ionen- und pH-Gradienten kommen zum Einsatz. Wyatt Technology führt im Rahmen der Geräteinstallation die entsprechende Integration durch.

Wyatt Technology Komplettsystem SEC/GPC
Wyatt Technology bietet für die makromolekulare Charakterisierung optimierte Komplettsysteme, GPC-Systeme bzw. SEC-Systeme, an. Sie sind speziell für wässrige und / oder organische Laufmittel konfiguriert. Natürlich kann neben MALS auch eine DLS-, Vis-, DRI-, UV-, DAD- und Fl-Detektion gekoppelt werden. Die Anbindung von Fraktionssammlern ist ebenso möglich wie die Kombination mit Micro-Spottern. Für spezielle Anwendungen sind überdies biokompatible oder metallfreie Anlagen verfügbar.

Komplettsysteme mit FFF
Der TREOS^® Streulichtdetektor kann als Detektor auch an die FFF (Feldflussfraktionierung) gekoppelt werden. Die Feldflussfraktionierung ist ein schonendes und leistungsfähiges Verfahren für die Trennung von Makromolekülen und Partikeln. Die Trennung erfolgt im Fluss ohne stationäre Phase. Wyatt Technology bietet leistungsstarke Systeme für die Asymmetrische Feldflussfraktionierung (AF4), Frit Inlet Feldflussfraktionierung (FI FFF) und Hohlfaser Feldflussfraktionierung (HF5) an.

Inline Zellreinigung
Wyatt Technology hat das Zellreinigungssystem COMET für den TREOS® Streulichtdetektor entwickelt. COMET ist ein Reinigungsgerät, das die Flusszelle mittels Ultraschalltechnik reinigt. Es ist in das TREOS® integriert, und die Reinigung lässt sich per Software aktivieren. Durch die automatisierte Säuberung der Messzelle erhöht sich die Produktivität des Systems.

Kombination mit DLS
MALS ermöglicht durch die simultane Messung des Streulichtes bei verschiedenen Winkeln die Bestimmung der Molekülgröße in Form des Gyrationsradius. Optional kann ein DLS (Dynamische Lichtstreuung) Detektor in den TREOS^® Streulichtdetektor integriert werden. Durch die Kombination beider Messmethoden, MALS und DLS, lassen sich Gyrationsradius und Hydrodynamischer Radius simultan bestimmen. Das Verhältnis dieser zwei Größen ermöglicht Aussagen über die Gestalt der gemessenen Moleküle und Partikel. Bei der Kopplung von MALS mit DLS wird nur eine Flusszelle eingesetzt, da es sich um eine integrierte Lösung handelt. Dies reduziert die sekundäre Bandenverbreiterung und vermindert den Gegendruck im Messsystem.

Protein-Konjugat-Analyse
Durch die Kombination von MALS mit RI und UV erhält man bei der Analyse von Protein-Konjugaten die Molmasse des Komplexes und zusätzlich die Molmasse des Proteins und der zweiten Komponente des Komplexes. Dadurch lässt sich die Zusammensetzung und die Molmasse der Komponenten des Komplexes bestimmen. Dabei kann es sich bei der zweiten Komponente um ein zweites Protein, Polysaccharid, PEG oder eine andere Verbindung handeln. Diese Art der Analyse wird auch bei Membranproteinen angewendet. Als Ergebnis werden hierbei die Molmasse des Membranproteins und die Molmasse der Mizelle bestimmt.

Kombination mit online Viskositätsmessung
Die Kombination aus online Viskositätsmessung (Vis) und MALS ermöglicht eine umfassende Charakterisierung von Polymeren. Neben den absolut gemessenen Molmassen sind die spezifische Viskosität und der Hydrodynamische Radius verfügbar. Dies ermöglicht die Bestimmung der molekularen Gestalt aus einer Messung mithilfe des Kuhn-Mark-Houwink-Sakurada Plots. Zudem kann man – in Kenntnis der Gyrationsradien sowie der Viskosität - Verzweigungsanalysen durch Anwendung der Zimm-Stockmeyer Theorie durchführen.

Batch-Messungen
Neben der Kopplung an die Chromatographie kann der TREOS^® Streulichtdetektor auch als  „Stand Alone“-Gerät im Batch-Modus eingesetzt werden. Dabei sind neben der Molmasse und dem Radius auch der zweite Virialkoeffizient (A2) messbar. A2 ist ein Maß für die Löslichkeit von Substanzen und findet Anwendung im Bereich Proteinkristallisation und Proteinformulierung. Als Ersatz für die klassische und relativ zeitintensive Methode der Messungen im Batch-Modus per Küvette hat Wyatt Technology das online A2 Verfahren entwickelt. Diese Methode erlaubt die automatisierte Bestimmung dieses Parameters. Zudem lassen sich die Stöchiometrie und die Bindungskonstante von Protein-Protein-Komplexen bestimmen.

ASTRA Software
Die Detektoren von Wyatt Technology sind mit der ASTRA© 6 Software  erhältlich. ASTRA© stellt alle Funktionen für die Charakterisierung von Polymeren und Proteinen zur Verfügung und unterstützt Batch-Messungen gen ebenso wie chromatographische Messungen mit SEC/ GPC/ FFF, Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS), Dynamische Lichtstreuung (DLS), Konzentrationsbestimmung (RI & UV) und Viskositätsmessung (VI).

ASTRA© überzeugt mit umfangreicher Funktionalität und einer komfortablen Benutzeroberfläche, die sehr effizientes Arbeiten ermöglicht. Ein Schwerpunkt ist die Automatisierung der Arbeitsabläufe. Ein Assistent führt durch die Erstellung von neuen Methoden, die sich mit wenigen Klicks komplett konzipieren lassen.

Basislinien und Auswertebereiche sind automatisch bestimmbar. Mit dem leistungsfähigen WYSIWYG („what you see is what you get“) Report Editor kann der Anwender per Maus  alle Informationen komfortabel ein- oder ausblenden.

ASTRA© erlaubt auf einfache Weise den Vergleich verschiedener Messungen, bzw. Proben. Messungsübergreifend werden Ergebnisse grafisch in EasyGraph und numerisch in EasyTable gegenüber gestellt oder zusammengefasst.

Zusätzliche Funktionen wie die Bestimmung der statistischen Präzision der Messungen, Korrektur der sekundären Bandenverbreiterung, Berechnung der Anzahl der theoretischen Böden sowie für die  Darstellung der differentiellen und kumulativen Molekulargewichtsverteilungen stehen bereit. Außerdem erlaubt ASTRA die detaillierte Analyse von Copolymeren, Verzweigungen und Proteinkomplexen.

Typische TREOS^® Protein-Anwendungen

• Charakterisierung von Peptiden, Proteinen und Aggregaten
• Proteinkristallisation, Proteinformulierung, Qualitätskontrolle
• Pegylierte und glycosilierte Proteine, Protein-Komplexe
• Membranproteine

Typische TREOS^® Polymer-Anwendungen

• Charakterisierung von organischen Polymeren und Biopolymeren
• Konformationsanalyse, Verzweigungsanalyse
• Kuhn-Mark-Houwink-Sakurada Plots