Wyatt Technology DynaPro NanoStar™: Bestimmen Sie die Größe und Struktur Ihrer Proteine !

Dynamische Lichtstreuung (DLS) ist eine aus Forschung und Entwicklung nicht mehr wegzudenkende Methode für die Charakterisierung von Proteinen. Mittels DLS werden mittlerer hydrodynamischer Radius von Molekülen und die Radienverteilung sowie die Polydispersität einer Probe gemessen.

Mit DLS kann man schnell und akkurat Aggregate bestimmen und Aussagen zur Gestalt der Proteine treffen. Außerdem lässt sich mit dem NanoStar die Stabilität von Proteinlösungen anhand der Schmelzpunktanalyse oder mithilfe des zweiten Virialkoeffizienten bestimmen. Die Messungen sind innerhalb von einer Minute, also sehr schnell, durchführbar. Zudem wird die Probe dabei weder zerstört noch verdünnt – ideale Voraussetzungen für ihre Rückgewinnung.

DLS ist eine etablierte Methode bei Produktion, Reinigung und Kristallisation von Proteinen. Sie erlaubt die Bestimmung des Aggregationszustands und ermöglicht bei der Proteinkristallisation Aussagen über die Kristallisationsfähigkeit der Probe.

Bei zahlreichen Anwendungen ist auch die Bestimmung des Molekulargewichtes eines Proteins von Bedeutung, beispielsweise um zu untersuchen, ob dieses als Monomer oder als Oligomer vorliegt. Die mittels DLS bestimmten Molekulargewichte werden allerdings anhand der Beziehung zwischen Radius und Masse berechnet. Daraus folgt, dass das aus dem hydrodynamischen Radius berechnete Molekulargewicht von der tertiären Struktur des Proteins abhängt.

Um dieser Situation zu begegnen, verfügt dasDynaPro NanoStar (1) von Wyatt Technology als einziges DLS Instrument auf dem Markt über eine zusätzliche 90° Streulichtdiode für die Statische Lichtstreuung (SLS). Mittels dieser Methode wird das Molekulargewicht absolut aus der Gesamtmenge des Streulichtes bestimmt, und zwar ohne Annahmen über die Gestalt des Moleküls. Somit kann das NanoStar simultan hydrodynamische Radien mittels DLS und absolute Molekulargewichte mittels SLS messen. Neben den Batch-Messungen kann man das NanoStar auch an einen Wyatt Technology DAWN Streulichtdetektor (MALS) anschließen. Damit ist die Kopplung dieser Messmethode an SEC/GPC sowie Fluss- und Hohlfaser-Feld-Fluss-Fraktionierung (AF4 / HF5) gewährleistet, und Molekulargewichte sowie hydrodynamische Radien lassen sich online bestimmen. Das NanoStar ermöglicht die Temperierung der Probe zwischen -15 und 150 °C, auch sind Temperaturgradienten und frei definierbare Temperaturprofile anwendbar. Das NanoStar ist mit einigen technischen Besonderheiten ausgestattet, die das Arbeiten mit dem Gerät sehr einfach machen. Ein Beispiel dafür ist die automatische Steuerung der Lichtintensität an der Diode und der Laserleistung.

Das Gerät verfügt über einen Laser mit 100 mW, der bei einer Wellenlänge von 658 nm arbeitet. Durch seine hohe Lichtintensität wird ein sehr gutes Signal/Rauschverhältnis erreicht. Lysozym, ein Protein mit einem Molekulargewicht von 14 kDa, kann daher noch in einer Konzentration von 0.1 mg/mL reproduzierbar gemessen werden. Hat die Substanz ein höheres Molekulargewicht, steigt die Empfindlichkeit linear an, weil entsprechend mehr Streulicht entsteht.

Das NanoStar wird mit Wyatts benutzerfreundlicher DYNAMICS-Software geliefert, bei der besonders auf einfache Bedienung Wert gelegt wurde. Spezielle Anpassungen an die geforderte Applikation sind genauso möglich wie beispielsweise eine Einknopfbedienung. Zusätzlich besitzt DYNAMICS einen Editor, der es ermöglicht, auch komplexe Messabläufe zu realisieren. Alle Messparameter sind in Voreinstellungen, den sogenannten „Presets“, speicherbar. Wird das Gerät von vielen Benutzern verwendet, so kann jeder Anwender seine individuellen Einstellungen ablegen.

Für die Durchführung der Messungen kann man neben der 1 µL Quarzglasküvette auch Einwegküvetten einsetzen. Verfügt man über ausreichend Probe, so bietet sich die Verwendung von 50µL Eppendorf UVetten an. Für Messungen mit Einwegküvetten bei kleinsten Probevolumina gibt es die neuen 4 µL Einwegküvetten von Wyatt Technology. Diese wurden speziell für den Einsatz im NanoStar entwickelt. Eine solche Küvette ist in Abbildung 2 gezeigt. Die dunkle Flüssigkeit in der Mitte Küvette stellt Probelösung dar. Sie ist, getrennt durch eine Einfassung, umgeben von Lösungsmittel (braune Flüssigkeit). Diese Anordnung hält die Verdunstung von Lösemittel aus der eigentlichen Probe so gering wie möglich. Zudem kann man ohne die Zugabe von Lösemittel die Probe mit Paraffinöl überschichten, was den gleichen Effekt erzielt.

Spezifikationen:

• DLS Diode für Dynamische Lichtstreuung
• SLS Diode für Statische Lichtstreuung
• Kopplung an online MALS Detektoren
• Temperierung -15 bis 150 °C
• 1 µL Quarzglasküvette
• 4 µL Einwegküvette
• 50 µL Eppendorf UVetten

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