Schnelle Herstellung von reinen Peptiden mit schwierigen Sequenzen in der Mikrowelle

Proteine bzw. Peptide spielen für die physiologische und biochemische Funktion lebender Organismen eine herausragende Rolle. Seit langem werden diese Wirkstoffe auf ihre pharmakologische Wirksamkeit untersucht. Inzwischen ist es wichtig, unterschiedliche Peptide synthetisch in Forschungslaboratorien herzustellen.

Nach anfänglicher Skepsis der meisten Peptidchemiker hat sich in den letzten Jahren der Einsatz der Mikrowelle bei der Synthese von Peptiden mehr und mehr durchsetzen können.

Zahlreiche Publikationen der letzten Jahre [M.-S. Park, Tetrahedron Letters 48/6 (2007), 1053-1057; H.J. Olivos, Organic Letters 4/23 (2002), 4057-4059; A.M. Papini, Chemistry Today 26/4 (2008), 36-38; F. Rizzolo, International Journal of Peptide Research 13/1-2 (2007), 203-208] belegen, dass unter Mikrowelleneinwirkung gerade sehr schwierige Sequenzen gut synthetisierbar werden, was vor allem auf die Eliminierung der Aggregationsproblematik hydrophober Peptidketten zurückzuführen ist.

Hervorzuheben ist, dass es in der Mikrowelle trotz thermischer Effekte zu einer Unterdrückung der Racemisierung kommt [S.A. Palasek, Journal of Peptide Science 13/3 (2007), 143-148]. Auch andere klassische Nebenreaktionen in der Peptidsynthese wie z.B. Aspartimidbildung können durch Optimierung der Reaktionsbedingungen in der Mikrowelle minimiert werden.

Durch die zunehmende Verbreitung der Mikrowellenpeptidsynthese werden natürlich auch die Protokolle zur Peptidsynthese zunehmend verfeinert und optimiert. So wird beispielsweise von vielen Anwendern das leichter zugängliche und weniger gesundheitsschädliche Piperazin zur Abspaltung der Fmoc-Gruppe benutzt. Durch all diese Optimierungen werden die Ausbeuten bei den einzelnen Syntheseschritten kontinuierlich optimiert, so dass die Kettenlänge der synthetisierbaren Peptide in den letzten Jahren deutlich gestiegen ist. In Verbindung mit einer geeigneten Capping / Tagging-Strategie lassen sich heutzutage auch Peptide mit mehr als 100 Aminosäuren sinnvoll an einem Stück synthetisieren.

Apparativ stehen dem Anwender dabei mittlerweile sowohl manuelle als auch voll automatisierte Systeme zur Verfügung. Für die manuelle Peptidsynthese findet das Discover SPS Anwendung, in dem Ansatzgrössen von bis zu 3mmol realisierbar sind. Ein durchschnittlicher Kopplungszyklus (incl. Waschvorgängen) dauert in diesem System ca. 10 Minuten, so dass hier pro Stunde bis zu 6 Aminosäuren gekoppelt werden können.

Mit steigender Peptidlänge macht die Anwendung eines automatisierten Systems Sinn – nicht zuletzt aufgrund der höheren Zuverlässigkeit. Hierfür steht mit dem Liberty ein voll automatisiertes System zur Verfügung, das in den letzten Jahren software- und hardwaretechnisch so weit optimiert wurde, dass mittlerweile praktisch jede Art von Chemie auf einfache Art und Weise implementiert werden kann.

Das Gerät ermöglicht die Verwendung von bis zu 25 verschiedenen building blocks (die gängigen Reagentien sind bei CEM bereits fertig abgewogen kommerziell erhältlich) und verfügt über 12 Harzpositionen, d.h. es können bis zu 12 Peptide nacheinander synthetisiert werden. Die Ansatzgrösse ist dabei im Bereich von 0.1mmol bis 5.0mmol frei wählbar. Für die weiteren benötigten Reagentien (Aktivator, Base, Capping, Lösungsmittel) stehen 5 weitere ports zur Verfügung, die genau wie die Positionen der building blocks frei vom Anwender definiert werden können, so dass das System an Flexibilität kaum zu überbieten ist.

In der Regel genügen zwar die mit der software mitgelieferten Syntheseprotokolle, allerdings hat der Anwender die Möglichkeit eine individuelle Optimierung der Reaktionsbedingungen durchzuführen. So ist z.B. eine Anpassung der Stärke der Mikrowelleneinstrahlung per Mausklick möglich und auch kompliziertere Reaktionen wie z.B. die zwischenzeitliche Abspaltung orthogonaler Schutzgruppen (z. B. Allyl) ist ohne grossen Aufwand realisierbar.

In der Regel sind jedoch auch ohne aufwendige Optimierungen mit den Standardprotokollen sehr gute Ergebnisse realisierbar. Ein gutes Beispiel für ein „schwieriges Peptid“ stellt das beta-Amyloid dar, welches ein aus der Alzheimer Forschung bekanntes 42mer darstellt. Unter konventionellen Bedingungen wird das Peptid in einer Reinheit von nur 10 % gewonnen, während mit dem Liberty und Verwendung von Standardprotokollen (d.h. ohne Optimierung) bereits eine Rohprodukt-Reinheit von 69% erreicht wird.

Zur Komplettierung des Angebotes im Bereich der Peptidsynthese steht seit Mitte 2009 auch ein System zur Verfügung, welches die Abspaltung und Entschützung der synthetisierten Peptide mit Mikrowellenunterstützung ermöglicht.

Das Accent-Modul ermöglicht die normalerweise Stunden dauernde Abspaltung des Peptides vom Harz in 15 Minuten, wobei aufgrund der kurzen Reaktionszeit deutlich weniger Nebenprodukte auftreten. In kleineren Ansätzen ist auch ein microcleavage in nur 2 Minuten realisierbar, so dass eine fortlaufende Synthese damit praktisch in Echtzeit monitorierbar ist. Nicht nur die reine Synthese, sondern auch der Prozess der Syntheseoptimierung ist damit in der Mikrowelle deutlich beschleunigt. Eine Anwendung der beschriebenen Systeme ermöglicht gerade im Bereich der Wirkstoffentwicklung und -optimierung eine Beschleunigung der sonst oft sehr zeitraubenden Prozesse um ein Vielfaches.

Nur diese Mikrowellen-Peptid-Synthesizer ermöglichen den patentierten Einsatz der Mikrowellen-Aktivierung bei der Kopplung und Entschützung. Zum Lieferumfang gehört ein Zertifikat zur Nutzung dieser Patente für die Peptid-Synthese und es kann somit für Veröffentlichungen oder Patentanmeldungen von neuen Peptiden genutzt werden.

UV-Monitoring optimiert die Peptid Synthese

Das neue UV-Monitoring Kit kann bei allen Liberty12 und Liberty1 Mikrowellen-Peptid-Synthesizern eingesetzt werden. Es gibt während der Synthese darüber Auskunft, ob alle Schutzgruppen abgespalten wurden und nun die nächste Aminosäure an das bereits synthetisierte Peptid angekoppelt werden kann. Die Software steuert diesen Schritt in Anhängigkeit der Menge an abgespaltenen Schutzgruppen. Je nach Ergebnis wird der Deprotection Schritt wiederholt, bis Gewissheit erlangt wurde, das nun der nächste Kopplungsschritt erfolgen kann.

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