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Die Hohlfaser-Feldfluss-Fraktionierung (HF5): Eine neue, leistungsfähige Methode zur Auftrennung komplexer Proteingemische

Christoph Johann, Thomas Jocks
Wyatt Technology Europe GmbH, 56307 Dernbach

Die Fluss-Feldflussfraktionierung (F4) ist eine Familie von Trennmethoden für Moleküle und Partikel,  bei der man sich einen hydrodynamischen Querfluss für die Separation zunutze macht. In der Fachwelt bekannt und bereits verbreitet ist die Asymmetrische Fluss-Feldflussfraktionierung (AF4), bei der ein flacher, länglicher Trennkanal eingesetzt wird.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Strömungsverhältnisse im Hohlfaser-Kanal

In diesem Beitrag stellen wir Ihnen die Hohlfaser-Fluss-FFF (HF5) von Wyatt Technology vor. Der Kanal besteht aus einer Faser mit porösen Wänden. Wird ein Flüssigkeitsstrom durch die Faser hindurch gepumpt, so kann ein Teil der Strömung durch die Wände austreten und bildet eine Querströmung (Cross-flow) im Verhältnis zur Hauptströmung, die entlang der Faser Richtung Auslass gerichtet ist. Durch Einwirkung des Querstromes, der sich überlagert mit dem parabolischen Flussprofil der Längsströmung, erfolgt eine Trennung der Probenbestandteile entsprechend ihrem Diffusionskoeffizienten (Abbildung 1).

Der Einsatzbereich der HF5 ist ähnlich breit gefächert wie bei den anderen F4-Methoden. Dabei lassen sich sowohl gelöste Moleküle als auch Partikel im gleichen Trennvorgang untersuchen. Dies kommt z.B. dann zum Tragen, wenn „freies“ Reagenz unterschieden werden soll von dem Anteil, der an Partikel gebunden hat. Das ist eine Aufgabe, die sich vor allem bei der Entwicklung von „Colloidal Drug-Carrier“ Systemen stellt [1]. Die Trennmethode arbeitet ohne stationäre Phase. Daher kommt es auch weit weniger zu Wechselwirkungen wie zum Beispiel der Absorption von Probenmaterial. Ein weiterer Vorteil der HF 5 ist die geringe Probenverdünnung, so dass man für die anschließende Analyse auch die Massenspektrometrie einsetzen kann. Erste Ergebnisse belegen, dass die HF5 zu einem wichtigen Werkzeug in der Proteomics-Forschung werden kann [2-5]. Zudem stellt auch die Umweltanalytik ein Anwendungsgebiet dar, etwa wenn es um den Nachweis von schädlichen Nanomaterialien geht.

HF5-Kartuschen kann man kostengünstig als Einmalartikel herstellen. Das eliminiert auf elegante Weise sämtliche Probleme, die in der Vergangenheit bezüglich Kammersterilität oder Probenverschleppung auftraten. Während in der AF4 der Kanal geöffnet werden muss, um die Flachmembran zu wechseln, kann in der HF5 der gesamte Kanal bzw. die Trennkartusche ausgewechselt werden. Dies erhöht auch die Produktivität deutlich.

Die HF5 ist diejenige Methode in der Fluss-FFF-Familie, die eine hohe Trennleistung mit geringer Probenverdünnung und damit hoher Nachweisempfindlichkeit bei der Detektion verbindet.

Aus diesen Stärken ergeben sich naturgemäß auf der anderen Seite die Limitationen der HF5. Der kleine Kanal bietet wenig Platz und wird bei zu hoher Probenbeladung Überladungseffekte zeigen. Es ist deshalb wünschenswert, die HF5 als zusätzliche Methode verfügbar zu haben, ohne auf die Nutzung des Flachkanals (AF4) verzichten zu müssen.

Wir stellen hier ein System für die Feldfluss-Fraktionierung vor, das sowohl mit AF4- als auch mit HF5-Trennkanälen betrieben werden kann [6]. Es erlaubt den flexiblen Wechsel zwischen beiden Trennmodi. Außerdem zeigen wir innovative Problemlösungen auf, mit denen bislang limitierende Eigenschaften der HF5 verbessert wurden. Durch das völlig neue Konstruktionsprinzip  wird der routinemäßige Einsatz der HF5 ermöglicht und die Leistungsfähigkeit der Fluss-FFF einem breiten Anwenderkreis zugänglich. Die Feldflussfraktionierung ist damit nicht aufwändiger als eine HPLC-Trennung.

Abbildung 2: Die von Wyatt neu entwickelte Hohlfaser - Kartusche (HF 5) für die Feldflussfraktionierung

Der in Abb. 2 gezeigte HF5-Kanal stellt eine Neukonstruktion dar (zum Patent angemeldet). Die Kartusche enthält eine Hohlfasermembran aus Polyäther-Sulfon (Durchmesser 0,8 mm) mit Ausschlussgrenzen von 10 bzw. 30 kDa. Sie hat zusätzlich zum Cross-Flow Auslass jeweils eine Einlass- und eine Auslassöffnung wie eine Chromatographiesäule.

Der AF4 - Kanal

Um das Umschalten zwischen beiden Trennmodi zu vereinfachen, wurde ein völlig neuer AF4-Kanal entwickelt. Dieser besitzt wie die HF5-Kartusche nur zwei Anschlussöffnungen. Die Injektion der Probe erfolgt mit der mobilen Phase über den Einlass. Es wird keine Spacerfolie verwendet. Der Flussraum, in dem die Trennung stattfindet, ist in die obere Platte des Kanals eingebracht.

Die zuverlässige Abdichtung des Kanals gegenüber der Membran wird mit Hilfe einer speziell konstruierten Dichtfläche erreicht (zum Patent angemeldet), die gegenüber herkömmlichen Konstruktionen mit Spacerfolien weniger Anpressdruck benötigt. Dadurch lassen sich auch Kanäle mit großer Grundfläche abdichten, die beispielsweise für semi-präparative Trennungen geeignet sind.

Weitere Instrumente

In dieser Studie wurden außerdem noch benutzt: HPLC von Agilent Technologies (Santa Clara, USA) mit einem Degasser Agilent 1100, eine isokratische Pumpe Agilent 1100, ein Auto Sampler Agilent 1200 sowie ein Agilent 1100 (VWD) Detektor.

Ein DAWN HELEOS II 18-Winkel Lichtstreudetektor (MALS-Detektor) und ein Differenzial-Refraktometer Optilab rEX (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, USA) kamen ebenfalls zum Einsatz. Weitere Informationen zu Material und Methoden sind in der folgenden Publikation zu finden:

Christoph Johann, Stephan Elsenberg, Ulrich Roesch, Diana C. Rambaldi, Andrea Zattoni, Pierluigi Reschiglian

A novel approach to improve operation and performance in flow field-flow fractionation  

Original Research Article, Journal of Chromatography A, Dezember 2010

Ergebnisse und Diskussion:

Um die Trennleistung und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu überprüfen, wurden nacheinander 100 Trennläufe mit Rinder-Serum-Albumin (BSA) auf demselben HF5-Modul durchgeführt.

Abbildung 3: Fraktogramme aus dem 11. (blau), dem 60. (grün) und dem 91. (rot) Lauf sowie die mittels Lichtstreuung gemessenen Molmassen aus den eluierten Fraktionen

Exemplarisch sind in Abbildung 3 die Fraktogramme aus dem 11. (blau), dem 60. (grün) und dem 91. (rot) Lauf aufgetragen.

Die mittels Lichtstreuung gemessenen Molmassen aus den Fraktionen sind dort ebenso dargestellt. Sie stimmen mit dem zu erwartenden Wert von 67 kDa sehr gut überein. Auch nach 100 Injektionen ist die Effizienz der Trennung unverändert gut.

Abbildung 4: Vergleich der Peak-Höhe bei Hohlfaser und Flachkanal: die geringere Probenverdünnung in der Hohlfaser erhöht die Sensitivität in der Detektion

Die Ergebnisse bestätigen die geringe Probenverdünnung, wodurch eine hohe Nachweisempfindlichkeit ermöglicht wird (Abb. 4). Gezeigt ist die Höhe des UV-Signals als Funktion der Aufgabemenge des Enzymproteins Carboanhydrase (CAH) im Vergleich zwischen HF5 und zwei verschiedenen AF4 Kanälen, SC und LC. Die Kanalhöhe ist vergleichbar (HF5 Radius 400 µm, Kanalhöhe der AF4 Kanäle 350 µm). Aufgrund des geringen Kanalvolumens sind die Peaks nach der HF5 Trennung um den Faktor 4 bzw. 6 höher.

Abbildung 5: Das Fraktogramm zeigt die Trennung aller vier Proteine im Gemisch mittels Hohlfaser - Technologie

Abbildung 5 zeigt das resultierende Fraktogramm mit den RI-Signalen und den Molmassen, die mit dem MALS-Detektor bestimmt wurden. Obwohl keine vollständige Basislinientrennung erfolgte, wurde bei den Molmassen eine hohe Genauigkeit erzielt. Gegenüber bisher publizierten Daten [7] zeigt sich eine signifikante Verbesserung der Trennleistung bei guter Reproduzierbarkeit (Daten nicht gezeigt).

Aus den theoretischen Grundlagen der FFF-Trennung hat Wyatt Technology unter der Bezeichnung „ISIS“ eine Software entwickelt, die es auch einem unerfahrenen Anwender leicht macht, für den jeweiligen Fall die optimale Trennmethode zu erarbeiten.

Schlussfolgerungen:

Die Resultate zeigen, dass die HF5 nunmehr eine ebenso gute Trennung liefert wie die bewährten AF4 Kanäle. Die Vorteile der HF5 in Bezug auf hohe Sensitivität können ohne Einbußen bei der Effektivität ausgeschöpft werden. Der HF5 Kanal kann einfach und kostengünstig gegen einen neuen ausgetauscht werden. Das neue F4-System, das hier vorgestellt wird, zeichnet sich gegenüber literaturbekannten Instrumenten durch eine Reihe besonderer Eigenschaften aus:

  1. Es wird nur eine Pumpe benötigt.
  2. Den Querfluss reguliert ein Flussmessgerät anstelle einer zusätzlichen Pumpe.
  3. Die Fokusposition wird auf neuartige Weise festgelegt und kann verändert werden; dies verhindert das unbeabsichtigte „Wandern“ des Fokus in einen suboptimalen Bereich.
  4. Die kostengünstige HF5-Kartuschenherstellung ermöglicht die Einwegverwendung (steril, kontaminationslos); Kartuschenwechsel innerhalb von Sekunden
  5. Automatisiertes Umschalten auf den AF4-Kanal ist in einem Gerät realisiert. Der neu entwickelte AF4-Kanal hat nur zwei Anschlüsse und ist kompatibel mit der HF5.
  6. Mittels ISIS Software können Trennmethoden am Computer optimiert und von einer Kanalgeometrie zu einer anderen umgerechnet werden.

Damit bietet die neue Eclipse Dualtec dem Anwender ein Höchstmaß an Sensitivität, Flexibilität und Produktivität.

Literatur:

[1] Zattoni A, Rambaldi D, Reschiglian P, Melucci M, Krol S, Coto Garcia AM, Sanz-Medel A, Roessner D, Johann C.,  J Chromatogr A 1216:9106-9112 (2009)

[2] P. Reschiglian, A. Zattoni, L. Cinque, B. Roda, D. Melucci, F. Dal Piaz, A. Roda, M.H. Moon, B.R. Min. Anal. Chem. 76, 2103-2111(2004)

[3] P. Reschiglian, A. Zattoni, B. Roda, L. Cinque, D. Parisi, A. Roda, M. H. Moon, B. R. Min, F. Dal Piaz, Anal. Chem. 77, 47-56 (2005)

[4] A. Roda, D. Parisi, M. Guardigli, A. Zattoni, P. Reschiglian, Anal. Chem. 78, 1085-1092 (2006)

[5] A. Zattoni, D.C. Rambaldi, B. Roda, D. Parisi, A. Roda, M.H. Moon, P. Reschiglian, J. Chromatogr. A 1183, 135-142 (2008)

[6] S. K. Ratanathanawongs Williams, D. Lee, J. Sep. Sci. 29, 1720 – 1732 (2006)

[7] I. Park, K-J Paeng, D Kang, MH Moon, J. Sep. Sci. 28, 2043–2049 (2005)

Publikationen:
A novel approach to improve operation and performance in flow field-flow fractionation

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