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Hormonbestimmung mittels GC-C-IRMS

eVol® reduziert Kontaminationen durch Lösemittel und Plastikpipetten

Eva Gorrebeeck und Veronique Dal, FASFC (Federal Agency for the Safety of the Food Chain), ISORA Department (Isotopes Ratio) Gentbrugge, Belgien

Totalionenchromatogramm beim Einsatz von Pipettenspitzen

Abbildung 1. Totalionenchromatogramm bei der Verwendung von Kunststoff-Pipettenspitzen, zeigt Störpeak bei 12,49 Minuten.

Die belgische Federal Agency for the Safety of the Food Chain (FASFC) ist eine Föderal-Agentur für die Sicherheit der Nahrungsmittelkette  und spielt eine zentrale Rolle bei der Risikobewertung durch offizielle Kontrollen und Inspektionen.  Die FASFC ist verantwortlich für das Erstellen, Implementieren und Durchführen von Maßnahmen  zur Analyse und zum Risikomanagement bei gesundheitsrelevanten Aspekten für Verbraucher.

Die FASFC unterhält fünf verschiedene Untersuchungslabors in Belgien. Das ISORA Labor in Gentbrugge  hat sich auf die Rückstandsanalytik in Lebensmitteln mittels der gaschromatographischen  Isotopenverhältnis-Massenspektrometerie (GC-IRMS) spezialisiert. insbesondere der Ermittlung von Hormonen in Matrizen tierischen Ursprungs

Totalionenchromatogramm beim Einsatz von eVol®

Abbildung 2. Totalionenchromatogramm bei der Verwendung von eVol ®, zeigt keinen Störpeak bei 12,49 Minuten.

Beschreibung:

Bei körpereigenen und natürlichen tierischen Steroiden gibt es ein stabiles Verhältnis zwischen den C12 und C13-Isotopen. Wenn ein Tier eine Hormonbehandlung erhält, ändert sich dieses Verhältnis, da synthetische Moleküle weniger C13-Isotope enthalten.

Eine genaue Messung dieses Verhältnisses ist wichtig, um Proben mit synthetischen Molekülen zu identifizieren. Wenn Tiere mit Hormonen behandelt wurden, gilt das als ungesund und sie werden aus der Nahrungskette entfernt.

Abbildung 3. Ausgewähltes Ionenchromatogramm (m / z = 125,50 bis 126,50) mit Pipettenspitzen zeigt einen Störpeak bei 12,49 Minuten.

Die GC-C-IRMS Kopplung ist die Technik, die das ISORA Labor einsetzt, um das C13/C12 Verhältnis zu bestimmen. Die von einem GC eluierten Fraktionen werden in einem Reaktor bei 940°C verbrannt, bevor sie auf das IRMS-System übertragen werden; ein spezifische MS-System ist dann in der Lage, das C-Isotopenverhältnis zu identifizieren.

Methode:

Das Labor verwendet einen Gaschromatographen gekoppelt mit einem MS-System und einem durch einen Verbrennungsofen gekoppelten IRMS (Isotope-ratio mass spectrometry).

8 µl der aufbereiteten Probe wird auf eine Säule mit 5% Phenylphase, 30 m Länge x 0,25 mm ID x 0,25 µm Filmdicke, injiziert.

Bitte beachten Sie den Unterschied in der Intensität zwischen den Abbildungen 3 und 4.

Abbildung 4. Ausgewähltes Ionenchromatogramm (m / z = 125,50 bis 126,50) bei der Verwendung von eVol ® zeigt keinen Störpeak bei 12,49 Minuten.

10% der eluierten Fraktion gehen in den MS-Detektor und dienen somit zur Überwachung der Probenreinheit. Die restlichen 90% werden durch den Verbrennungsofen in das IRMS geleitet. Das IRMS basiert auf dem Nachweis von Kohlenstoff-Isotopen in CO2. Alle Fraktionen werden verbrannt und in CO2 umgewandelt. Deshalb ist es zwingend notwendig, möglichst frei von jeglichen Verunreinigungen zu arbeiten. Aus diesem Grund müssen die Proben mit einem hohen Maß an Reinheit hergestellt werden, um jedes Risiko eines Störpeaks durch Verunreinigung zu vermeiden.

Die Probenvorbereitung ist der kritische und am meisten zeitaufwendige Schritt der gesamten Methode.

Die in Methanol gelösten Proben werden in ein GC-Vial überführt und eingedampft, dann mit Pyridin und Essigsäureanhydrid derivatisiert. Nach der Derivatisierung werden die Proben wieder verdampft, mit Iso-Oktan gelöst in und mittels GC-C-IRMS-Kopplung analysiert.

Bei nahezu allen Arbeitsschritten kamen manuelle Spritzen, klassische Mikro-Pipetten und Multi-Pipetten für Multi-Dispenser zum Einsatz. Allerdings wurde beobachtet, dass die Lösungsmittel bei der angewandten Methode mit den Polymeren aus den Pipettier- Werkzeugen reagieren und störende Ghost-Peaks hervorriefen, die somit die Analyse verunreinigten. Deshalb hat das ISORA-Labor den Einsatz von eVol ®, der digitalen analytischen Spritze, getestet, um die Ergebnisse zu verbessern.

Vollständiger Scan beim Einsatz von Pipettenspritzen

Abbildung 5. Vollständiger Scan (m / z = 50,00 bis 400,00) mit Pipettenspitzen bei 12,46-12,50 Minuten.

Ergebnis:

Heute verwendet das ISORA-Labor Abteilung ausschließlich eVol ® für alle Arbeitsschritte von der Probenvorbereitung bis hin zum Abfüllen der Proben in die GC Autosampler Vials.

Basierend auf dem Prinzip der Direktverdrängung überwindet eVol ® das Problem der Lösungsmittel-Volatilität und liefert verbesserte Genauigkeit im Vergleich mit den Pipetten mit dem Luft-Verdrängungsmechanismus.

eVol ® nutzt die SGE Diamond Spritzen Technologie, bei der Proben-und Lösungsmittel nicht in Kontakt mit Polymeren kommen; der einzige Kontakt ist mit der Kolbenspitze aus PTFE. Als Konsequenz der Nutzung von eVol ® verschwanden alle durch Kontamination hervorgerufenen Störpeaks, was eine deutliche Verbesserung der Analyse bedeutet.

Weil mit eVol ® mehrere Arbeitsmethoden zur Verfügung stehen (u.a.Dispensieren, Mehrfach-Dispensieren) sind die einzelnen Arbeitsschritte wesentlich schneller erledigt und damit auch der gesamte Laborablauf.

Vollständiger Scan beim Einsatz von eVol®

Abbildung 6. Vollständiger Scan (m / z = 50,00 bis 400,00) mit eVol® bei 12,46-12,50 Minuten.

Zusammenfassung

Der Einsatz von eVol ® hat zu einer  Änderung der Methodik im gesamten Prozess der Probenvorbereitung für die GC-C-IRMS C Isotopenverhältnisanalyse geführt. Die Vorteile für das ISORA-Labor liegen in der Optimierung der Bedingungen bei der Probenvorbereitung und die Verbesserung der GC-C-IRMS Analysenergebnisse, weil das Risiko von Störpeaks minimiert und der Workflow maximiert wird. Weiterhin ist das Laborpersonal in der Lage, schneller zu arbeiten und gleichzeitig eine gute ergonomische Praxis zu erlangen. Das alles resultiert auch in der Erhöhung der Liquid-Handling-Genauigkeit.

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