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„Grüne Chemie“ durch verdünnte Säuren für Mikrowellenaufschluss

Bewertung verschiedener Oxidationsmittelmischungen für den Mikrowellenaufschluss biologischer Proben

Lucimar L. Fialho, Érica F. Batista, Amália G. G. Pessoa, Edenir R. Pereira-Filho, Joaquim A. Nóbrega, K. Dreblow

PTFE Aufschlussbehälter

Die Analyse von Feststoffen erfordert häufig eine Vorbehandlung vor der analytischen Bestimmung, die normalerweise der zeitintensivste Schritt des gesamten Prozesses ist.1,2

Die meisten der herkömmlichen Probenvorbereitungsmethoden für atomspektroskopische Techniken umfassen eine vollständige oder teilweise Matrixzersetzung (Aufschluss) unter Verwendung konzentrierter Säuren. Die üblicherweise verwendete Oxidationssäure ist HNO3.

Die Verwendung konzentrierter Säuren birgt immer ein bestimmtes Gesundheits- und Sicherheitsrisiko, insbesondere bei unerfahrenen Anwendern, wie zum Beispiel Verätzungen oder Gesundheitsprobleme bei Inhalation. Dies bedeutet zudem eine höhere Verdünnung der Lösungen, was einen erhöhten Versorgungsaufwand mit sich bringt.3 Zur Vermeidung dieser Schwierigkeiten wurden Verfahren basierend auf verdünnten HNO3-Lösungen für den Aufschluss biologischer Proben entwickelt.4,5

Die Effizienz verdünnter HNO3-Lösungen zur Oxidation organischer Substanzen kann durch die Regenerierung dieser Säure erklärt werden, die durch die Oxidation von NO zu NO2 gefördert wird und die Absorption dieser Verbindung in der Lösung gefolgt von der Disproportionierungsreaktion.2 Ein weiterer wichtiger Aspekt für das Verständnis dieses Prozesses ist das Temperaturgefälle in dem durch Mikrowellenstrahlung erhitzten Gefäß, das eine grundlegende Rolle bei der Regenerierung der Salpetersäure spielt.2

Aus diesem Grund wurden in dieser Studie mikrowellenunterstützte Aufschlussverfahren unter Verwendung von Lösungen untersucht, die 2, 7, oder 14 mol/l HNO3 enthalten. Die Verwendung von H2O2 wurde ebenfalls untersucht. Proben von Hühnerschenkel und -futter (Brachiaria brizantha Stapf. cv. Marandu) wurden als typische Beispiele für tierisches und pflanzliches Gewebe aufgeschlossen.

Material und Methoden | Reagenzien und Lösungen
Alle verwendeten Reagenzien waren analysenrein und entionisiertes Wasser (18.2 WM/cm), gewonnen mit Milli-Q® Plus Total Water System (Millipore Corp., Bedford, MA, USA), wurde verwendet um all Lösungen herzustellen. Zur Vermeidung von Kontaminationen wurden  Glas- und PP Behälter vor der Verwendung mit Reinigungsmittel gewaschen, mit 10 % v/v HNO3 für 24 h behandelt und schließlich mit entionisiertem Wasser gereinigt.

Konzentrierte HNO3 wurde vorab mittels sub-boiling Instrument BSB-939-IR distillacid (Berghof, Eningen) aufgereinigt. Die Lösung von Urea (Reagen, Rio de Ja-neiro, RJ, Brazil) in Wasser (15–5000 mg/l of C) ergab eine Referenzlösung für die externe Kalibration des Restkohlenstoffgehaltes. Aluminum, B, C, Ca, Cu, Fe, K, Mg, Mn, P und Zn wurden mittels ICP-OES (iCAP 6000, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) unter Verwendung einer externen Kalibration mit 0.14 mol/l HNO3 verdünnter Stammlösung (1000 mg/l) der Ana-lyten (Qhemis, Jundiaí, SP, Brazil) im Bereich von 1.0 to 20 mg/l. Eine NaOH Standardlösung (Qhemis 0.1968 mol/l) diente zur Säure-Base Titration für die Er-mittlung des Säuregrades.

Speedwave Mikrowellenaufschluss-System

Mikrowellenaufschluss
Für alle Experimente wurde ein Mikrowellenaufschluss-System  (Berghof, Eningen, Deutschland), das über zwölf Aufschlussgefäße verfügt, die vollständig aus TFM™-PTFE bestehen, benutzt (Fig. 1). Das Fassungsvermögen der Gefäße betrug 100 ml (DAP-100). Der maximale Betriebsdruck dieses Gefäßtyps beträgt 40 bar. Die maximale Betriebstemperatur beträgt 230 °C. Der Innendruck und die Probentemperatur wurden in Echtzeit kontrolliert und durch einen kontaktlosen optischen Sensor in jedem einzelnen Gefäß überwacht.

Zur Feststellung des Restkohlenstoffgehaltes in den Aufschlüssen wurden die aufgeschlossenen Lösungen durch ICP-OES (Thermo Fisher Scientific, Cambridge, UK) analysiert. Analysenbedingungen sind Tabelle 1 zu entnehmen. Die dargestellten Parameter sind eine Empfehlung des Herstellers. Argon 99.996 % (White Martins-Praxair, Sertãozinho, SP, Brazil) wurde bei allen ICP-OES Messungen verwendet.

Tabelle 1: Bedingungen ICP-OES

Parameter

Bedingungen

RF applied power (W)

1150

Nebulizer gas flow rate (l/min)

0.7

Coolant gas flow rate (l/min)

12

Auxiliary gas flow rate (l/min)

0.5

Sample flow rate (ml/min)

1.1

Viewing mode

Axial und/oder radial

Integration time (s)

5

Emission lines (nm)

Al II 167.079  K I 691.107

B I 249.773 Mg II 279.553

C I 193.091 Mn II 259.373

Ca I 431.865 P I 185.942

Cu I 327.396  Zn I 213.856

Fe II 259.940

Sample Preparation
Bei dieser Untersuchung wurden Proben von Tieren (Hühnerschenkel) und von Pflanzen (Futter) verwendet: Die Futtermittelprobe ist ein durch Embrapa Cattle-Southeast, São Carlos, SP, Brazil erhaltenes Referenzmaterial und wurde bei 65 ºC 48 Stunden lang ofengetrocknet. Die Hühnerschenkelprobe wurde vorher lyophylisiert und homogenisiert.

Danach wurden die Proben mit einer Kryomühle ge-mahlen. (Model 6750, CertiPrep Spex, Metuchen, NJ, USA).

Druckaufschlussbehälter aus massivem TFM™-PTFE wurden für die unterschiedlichen Aufschlüssen in dem Speedwave Mikrowellenaufschluss-System verwendet.

Verschiedene HNO3 Konzentrationen (2, 7, oder 14 mol/l) mit oder ohne Zugabe von konzentriertem H2O2 (30 % m/m) wurden bewertet.

500 mg der Probe wurde unter Verwendung einer analytischen Waage (model AY 220, Shimadzu, Kyoto, Japan) genau eingewogen. Das Futter und der Hühnerschenkel wurden unter Verwendung von 5.0 mL HNO3 (2, 7, oder 14 mol/l) und 2.0 ml 30 % m/m H2O2 oder nur 7.0 ml HNO3 (2, 7, oder 14 mol/l) in der Mikrowelle aufgeschlossen. Das Temperaturprogramm der Mikrowelle wurde wie in Tabelle 1 angezeigt ausgeführt. Die aufgeschlossenen Lösungen wurden quantitativ in Polypropylenflaschen überführt und mit Wasser bis zu 25 mL verdünnt. Es wurde eine weitere Verdünnung durchgeführt, um eine maximale Restsäure von 0.7 mol/l HNO3 vor den ICP-OES Messungen sicherzustellen.

Tabelle 2: Temperaturprogramm

Schritt

T [°C]

p [bar]

Ta [min]

Zeit [min]

Leistung [%]

1

170

30

5

5

40

2

190

30

5

30

70

3

50

30

1

10

0

4

50

0

0

0

0

5

50

0

0

0

0

Ergebnisse
Das Aufschlussergebnis wurde durch Messung des Restkohlenstoffgehaltes und des Säuregrades bewertet (Tabelle 3). Unter allen Bedingungen konnte aufgrund der niedrigen Restkohlenstoffgehalte zwischen 0.21 und 1.34 % die korrekte Aufschlusseffizienz für alle HNO3-Konzentrationen nachgewiesen werden. Der maximale Restkohlenstoffgehalt betrug 1.34 %, womit die vollständige Kompatibilität für weitere Bestimmungen durch ICP OES angezeigt wurde. Gemäß Castro et al.4 sollten effiziente Aufschlüsse eine vollständige Zersetzung des organischen Materials unter Verwendung minimaler Mengen an HNO3 ermöglichen und zu einem niedrigen Restkohlenstoffgehaltes und Säuregrad führen. Die in dieser Arbeit vorgestellten Bedingungen unterstützen die Beobachtungen von Castro et al. Diese Bedingungen tragen zur einer minimalen Verdünnung der Probenlösungen bei und vermeiden Verlust von Detektionsfähigkeit.

In der Tabelle 3 wird gezeigt, dass die Verwendung einer Aufschlusslösung bestehend aus HNO3 plus H2O2 zu den höchsten Restsäuregehalten führt. Es kann geschlussfolgert werden, dass einer kleinerer Teil des H2O2 thermisch zersetzt wird und das erzeugte O2 die Regenerierung von HNO3 während des Aufschlussprozesses fördert. Somit sind in allen Experimenten, bei denen H2O2 verwendet wird, die Restsäuregehalte ähnlich den Anfangssäuregehalten.

Tabelle 3: Der Kohlegehalt in den Aufschlüssen und die Restsäuren bei Aufschlüssen unter verschiedenen Bedingungen. (Durchschnitt ± Standardabweichung, n = 3)

Gefäß

Aufschluss Lösung

[HNO3] mol/l

Restkohlenstoffgehalt (%)

Restäuren (mol/l)

 

 

 

Hühnchenschenkel

Futtermittel

Hühnchenschenkel

Futtermittel

DAP-100+

HNO3

14

0.82 ± 0.05

0.21 ± 0.03

10 ± 0.5

7.5 ± 0.8

DAP-100+

HNO3

7

0.81 ± 0.03

0.28 ± 0.02

4.4 ± 0.1

4.4 ± 0.4

DAP-100+

HNO3

2

1.34 ± 0.02

0.66 ± 0.22

0.6 ± 0.1

0.4 ± 0.2

DAP-100+

HNO3:H2O2

14

0.84 ± 0.04

0.33 ± 0.03

13.3 ± 0.4

12.1 ± 1.7

DAP-100+

HNO3:H2O2

7

0.90 ± 0.02

0.40 ± 0.06

6.5 ± 0.3

6.4 ± 1.2

DAP-100+

HNO3:H2O2

2

1.16 ± 0.08

0.39 ± 0.01

2.2 ± 0.4

1.8 ± 0.5

Zur Bewertung der Genauigkeit der Methode wurden Apfelblätter (SRM 1515, NIST, Gaithersburg, MD, USA) analysiert. Etwa 200 mg einer Probe wurden unter Verwendung von 5.0 ml HNO3 (2 mol/l) und 2.0 ml 30 % m/m H2O2 aufgeschlossen.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 dargestellt. Die Wiederfindungsraten waren allgemein gut für alle Elemente außer Fe, das niedrig war (68 %). Normalerweise ist in Pflanzenblättern Fe an Si gebunden. Da kein HF für den Aufschluss verwendet wurde, ist es wahrscheinlich, dass sich die geringe Wiederfindung von Fe durch unaufgeschlossene Probenrückstände in der Probenmatrix erklärt.

Um die bestimmten und zertifizierten Werte zu vergleichen wurde ein t-Test durchgeführt. Es wurden kein Unterschiede bei Al (95 %), B (99 %), Ca (95 %), Cu (95 %), K (95 %), Mg (95 %) und P (95 %) beobachtet. Bei Fe, Mn und Zn beobachteten wir Unterschiede mit einem Vertrauensintervall von 95 beziehungsweise 99 %. Allerdings lagen die Wiederfindungsraten im Bereich von 68 % (Fe) bis 118 % (Zn). Der Restkohlenstoffgehalt lag bei bei 0.11 ± 0.02 %.

Trotz dieser Beobachtungen mittels t-Test muss erwähnt werden, dass die Standardabweichungen niedrig und die Wiederfindung innerhalb eines akzeptablen Bereichs waren.

Tabelle 4: Bestimmte und zertifizierte Werte (Durchschnitt ± Standardabweichung, n = 3) für Apfelblätter

Element

Bestimmter Wert (mg/kg)

Zertifizierter Wert (mg/kg)

Wiederfindung

(%)

Al

292 ± 33

286 ± 9

102 ± 12

B

26 ± 0.3

27 ± 2

97 ± 1

Ca

16.675 ± 1035

15.260 ± 150

109 ± 7

Cu

4.87 ± 0.58

5.64 ± 0.24

86 ± 10

Fe

56 ± 2

83 ± 5

68 ± 2

K

18.299 ± 1387

16.100 ± 200

114 ± 9

Mg

2.746 ± 172

2.710 ± 80

101 ± 6

Mn

51.4 ± 0.4

54 ± 3

95 ± 1

P

1.771 ± 113

1.590 ± 110

111 ± 7

Zn

14.8 ± 0.4

12.5 ± 0.3

118 ± 3

Schlussfolgerung
Die Ergebnisse beweisen, dass der mikrowellenunterstützte Aufschluss mit einem Speedwave-Mikrowellenaufschluss-System effizient ist. Die besten Aufschlüsse können durch Verwendung von 2 mol/l of HNO3 plus H2O2 ausgeführt werden. Für neun Analyte wurden quantitative Wiederfindungsraten erhalten. Es kann geschlussfolgert werden, dass der mikrowellenunterstützte Aufschluss unter Verwendung von verdünnten Säuren eine gute Alternative hinsichtlich der Entwicklung nachhaltiger chemischer Verfahren für die Probenvorbereitung ist.

Danksagung
Die Autoren bedanken sich bei Nova Analitica und Berghof für die Bereitstellung der Geräte.

References
1. Krug, F. J., Ed., Métodos de Preparo de Amostras: Fundamentos sobre Preparo de Amostras Orgânicas e Inorgânicas para Análise Elementar. 1st ed., Piracicaba, SP, Brazil, 2008.
2. Bizzi, C. A.; Flores, E. M. M.; Barin, J. S.; Garcia, E. E.; Nóbrega, J. A.; Microchem. J., 99 (2011) 193-196.
3. Arruda, M. A. Z., Ed., Trends in Sample Preparation. 1st ed., New York, Nova Science, 2007, v.1., 99 (2011) 193–196.
4. Castro, J. T.; Santos, E. C.; Santos, W. P. C.; Costa, L. M.; Korn, M., Nóbrega, J. A.; Korn, M. G. A.; Talanta, 78 (2009), 1378-1382.
5. Araújo, G. C. L.; González, M. H.; Ferreira, A. G.; Nogueira, A. R. A.; Nóbrega, J. A.; Spectrochim. Acta B 57 (2002) 2121-2132.

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