Sehen Sie das komplette Bild Ihrer Makromoleküle?

Einleitung

Die Gelpermeationschromatographie (GPC), auch anschaulicher als Größenausschlusschromatographie (engl. Size Exclusion Chromatography = SEC) bezeichnet, ist die am häufigsten eingesetzte Methode zur Bestimmung der Molekulargewichte von natürlichen und synthetischen Makromolekülen. Eine wesentliche Stärke dieser Methode liegt in der Tatsache begründet, dass durch den Trennprozess eine komplette Verteilung der in der Probe enthaltenen Molekulargewichte erhalten wird. Diese Molekulargewichtsverteilung besitzt einen wesentlich größeren Informationsgehalt für die Charakterisierung von polymeren Proben als ein einzelner Zahlenwert.

In der Anfangszeit der GPC war der Konzentrationsdetektor der einzige Detektor zur Bestimmung der Molekulargewichtsverteilung. Die Umsetzung des Konzentrationsdiagramms in Molekulargewichte erfordert die aufwendige Kalibrierung der Säulen durch bekannte Polymerstandards. Unterscheidet sich die Probe chemisch von den verwendeten Standards, so können nur relative Molekulargewichte ermittelt werden.

Durch den Einsatz molekulargewichtssensitiver Detektoren können diese Limitierungen aufgehoben werden. Die Kombination von Konzentrations-, Viskositäts- und Lichtstreudetektion zu einem Dreifachdetektionssystem hat sich aufgrund des überlegenen Informationsgehaltes als Standard etabliert.

Konventionelle Kalibrierung

Bei der konventionellen Methode zur Kalibrierung der GPC-Säulen werden kommerzielle Polymerstandards niedriger Polydispersität eingesetzt und deren Molekulargewichte gegen das Retentionsvolumen aufgetragen (siehe Abb. 1). Die Detektierung des Polymers erfolgt meist mit einem Differential-Brechungsindexdetektor (RI-Detektor, RI = Refractive Index [1]) oder einem UV-Detektor, falls das Polymer UV-sensitive Gruppen enthält. Aus dem Chromatogramm einer unbekannten Probe kann man durch Aufteilung der Fläche unter der Kurve und Übertragung der Retentionsvolumina der einzelnen Fraktionen auf die Kalibrationskurve die Molekulargewichtsverteilung berechnen.

full-screen

Abbildung 1: Trennung einer Lipidmischung auf NP RediSep Kartuschen.

Abbildung 1: Prinzip der konventionellen Kalibrierung. Mit Hilfe von eng verteilten Polymerstandards wird eine Kalibrationskurve erstellt. Damit werden die mittleren Molekulargewichte und der Polydispersitätsindex (PDI) der zu analysierenden Probe berechnet.

Dabei ist jedoch zu beachten, dass diese Technik nur relative Molekulargewichte liefern kann, da die verwendeten Kalibrierstandards in der Regel nicht die gleichen Eigenschaften wie die unbekannte Probe besitzen. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die Polymere bei der GPC nach Ihrer Größe (genauer: ihrem hydrodynamischen Volumen) und nicht nach ihrem Molekulargewicht getrennt werden. Das Volumen eines Polymermoleküls in Lösung hängt aber von der chemischen Konstitution, dem Aufbau (linear oder verzweigt) und auch der Konzentration ab. Dadurch können Polymere trotz identischem Molekulargewicht bei unterschiedlichen Retentionsvolumina eluiert werden, was dann zur Verfälschung des Molekulargewichtes führt.

Trotz dieser Einschränkung ist die Molekulargewichtsbestimmung mittels konventioneller Kalibrierung nach wie vor weit verbreitet, da nur geringe Anforderungen an den experimentellen Aufbau gestellt werden.

Universelle Kalibrierung

Die universelle Kalibrierung wurde 1967 von Benoit et al. [2] beschrieben und ermöglicht die exakte Bestimmung des Molekulargewichts, auch wenn die chemischen oder strukturellen Eigenschaften von Kalibrierstandards und Probe differieren. Dieses Verfahren beruht darauf, dass das Produkt aus intrinsischer Viskosität [η] und Molekulargewicht MW direkt proportional zu dem hydrodynamischen Volumen ist. Mit der Entwicklung des Vier-Kapillar-Viskosimeters (Abb. 2) durch Haney [3] fand dieses Verfahren Einzug in die GPC. Dieser patentierte Differential-Viskosimeter-Detektor erlaubte erstmals intrinsische Viskositäten, ohne die Nachteile bisheriger Kapillarviskosimeter (geringe Empfindlichkeit, Beeinflussung durch Pumpenpulsation, Lesec-Effekt) on-line zu bestimmen.

full-screen

Abbildung 2: Trennung von Peptiden auf RP RediSep Kartuschen.

Abbildung 2: Funktionsprinzip des Vier-Kapillar-Viskosimeters. Die Kapillaren 1 und 2 teilen den GPC-Fluß symmetrisch auf. Während die Probe im unteren Ast in der Probenkapillare einen Rückdruck aufbaut, fließt die Probe im oberen Ast druckfrei in ein Reservoir, so dass zu diesem Zeitpunkt reines Lösungsmittel durch die Referenzkapillare fließt. Aus dem Druckunterschied (DP) zusammen mit dem Einlassdruck (IP) wird die intrinsische Viskosität berechnet.

Bedenkt man, dass die GPC eine Separierungstechnik nach Molekülgröße ist, so wird der Vorteil des on-line Viskosimeters direkt ersichtlich. Durch die universelle Kalibrierung der Chromatographiesäulen wird eine Kalibrationskurve erzielt, welche die Abhängigkeit der Molekülgröße vom Retentionsvolumen darstellt, und die vom chemischen oder strukturellen Aufbau der zur Kalibrierung eingesetzten Polymere unabhängig ist. Da gleichzeitig die intrinsische Viskosität der Proben bestimmt wird, kann man sehr einfach das Molekulargewicht unbekannter Polymere bestimmen. Die universelle Kalibrierung kann also mit beliebigen kommerziellen Polymerstandards durchgeführt werden.

Durch den Einsatz eines Viskositätsdetektors und der universellen Kalibrierung wird die umfassende Charakterisierung einer unbekannten Polymerprobe ermöglicht. Neben der Bestimmung des absoluten Molekulargewichtes liefert dieses Verfahren gleichzeitig weitere signifikante Größen wie die intrinsische Viskosität und den Radius sowie deren Verteilung über die Probe.

Über die Mark-Houwink-Gleichung [η] = K · M^α, deren Parameter a und K ebenfalls bestimmt werden, können weitere Strukturinformationen erhalten werden. Für ideale Knäuel-Strukturen liegt der Wert für a im Bereich von 0,6 – 0,8; für kompaktere Strukturen (z.B. verzweigte Polymere) findet man Werte a < 0,5; steife Polymerketten und stäbchenförmige Polymere liefern a-Werte im Bereich 1 – 2.

Die Zimm-Stockmayer-Theorie [4] ermöglicht die Berechnung von Verzweigungsgraden, indem die intrinsischen Viskositäten von verzweigten und unverzweigten Polymeren verglichen werden.

(1)

Lichtstreuung

Zur Bestimmung des Molekulargewichtes werden in der GPC häufig Lichtstreudetektoren eingesetzt. Ein wesentlicher Vorteil besteht darin, dass eine Molekulargewichtsbestimmung ohne Kalibrationskurve möglich ist, da das gemessene Lichtstreusignal direkt proportional zu dem Molekulargewicht ist. Die Rayleigh-Gleichung (1) beschreibt den Zusammenhang zwischen der durch die gelösten Polymere gestreuten Lichtintensität, die durch das so genannte Rayleigh-Verhältnis R_θ ausgedrückt wird, der Polymerkonzentration c und dem gewichtsgemittelten Molekulargewicht M_w [5].

Dabei ist K eine optische Konstante, A₂ der zweite Virialkoeffizient und P(θ) der so genannte statische Strukturfaktor.

Abbildung 3: Winkelabhängigkeit der Rayleigh-Lichtstreuung. „Kleine“ Moleküle (Radius < ca, 15 nm) streuen das Licht isotrop, für größere Moleküle ist die Streuung des Lichts in Einstrahlrichtung aufgrund von Interferenzen bevorzugt. Bei 7° wird nahezu das volle Streulicht für alle mit der GPC-Analyse zugänglichen Polymere erfasst.

full-screen

Betrachtet man „kleine“ Makromoleküle, so findet eine gleichmäßige Streuung des Lichts in alle Richtungen statt, d.h. P(θ) = 1 für alle Winkel (Abb. 3). Die Größe der Makromoleküle ist hier in Relation zu der Wellenlänge des Laserlichts zu setzen. „Klein“ sind die Makromoleküle wenn ihr Durchmesser in Lösung kleiner als 1/20 der Laser-Wellenlänge ist. Bei einer häufig verwendeten Wellenlänge von 680 nm weisen Makromoleküle bis zu ca. 15 nm Radius keine Winkelabhängigkeit auf. Typische lineare synthetische Polymere erreichen diese Grenze erst bei Molekulargewichten über ca. 150.000 g/mol. Für verzweigte Polymere liegt die Grenze noch höher.

Bei größeren Makromolekülen führen die Interferenzen der einzelnen Streuzentren in einem Molekül zu einer abnehmenden Streulichtintensität mit zunehmendem Winkel, d.h. P(θ) ist abhängig vom Winkel. Um das korrekte Molekulargewicht zu erhalten, müßte das Streulicht beim Winkel θ = 0° gemessen werden, dies ist jedoch aufgrund des Primärstrahls des Lasers experimentell nicht zugänglich.

Es gibt verschiedene Ansätze, diese Problematik zu lösen, der konsequenteste Ansatz ist die Messung der Streulichtintensität bei einem Winkel so nahe wie möglich bei 0°, da nur so die Extrapolation oder Korrektur von Messdaten vermieden wird. Dieser als Kleinwinkellichtstreuung (engl.Low Angle Light Scattering, LALS) bekannte Ansatz wird durch die Nähe zum Laser-Primärstrahl und Reflexionen am Glas der Messzelle bei kleinen Winkeln erschwert und fand daher lange nur wenig Beachtung. Heute sind diese Probleme durch geeignetes Design der Messzelle und Ausblendung des Primärstrahls durch Umlenkspiegel gelöst. Das Streulicht bei 7° ist selbst bei den größten mit der GPC-Analyse zugänglichen Polymeren nur um ca. 1% niedriger als das bei 0°.

Grundsätzlich kann mit Hilfe der Lichtstreutechnik eine zweite Größe der Polymere bestimmt werden: der Trägheitsradius. Dieser Radius wird aus der Winkelabhängigkeit des Streulichtes bestimmt. Da unter einer Molekülgröße von 15 nm keine Winkelabhängigkeit vorliegt, ist eine Bestimmung des Trägheitsradius für viele Polymere durch das Messprinzip physikalisch unmöglich.

Triple Detection – Polymercharakterisierung mit 3 Augen

Unter dem Begriff Dreifachdetektion versteht man die Kombination von drei Detektoren, sozusagen der drei Augen, mit unterschiedlichem Informationsgehalt. Dies sind ein Konzentrationsdetektor (RI oder UV), ein Lichtstreudetektor, aus dessen Signal man das Molekulargewicht des Polymers erhält und ein Viskositätsdetektor, der sensitiv auf die molekulare Dichte reagiert. Dadurch können die Verteilung des Molekulargewichtes, der intrinsischen Viskosität und der Größe (Radius) der Polymere über den gesamten durch die GPC zugänglichen Molekulargewichtsbereich bestimmt werden.

Durch die doppellogarithmische Auftragung der intrinsischen Viskosität gegen das Molekulargewicht erhält man den Mark-Houwink-Plot log[η] = αlogM + logK. Dabei handelt es sich um die zentrale Strukturauftragung in der Polymeranalytik Sie zeigt Strukturänderungen des Polymers durch Verzweigung ebenso an wie das Knäuelungsverhalten der Polymerkette und damit die Kettensteifigkeit.

Da die physikalischen Eigenschaften der Polymerprobe unabhängig vom Retentionsvolumen direkt bestimmt werden, ist die Methode unempfindlich gegenüber ungünstigen chromatographischen Rahmenbedingungen, wie z.B. Flussratenschwankungen, Bandenverbreiterung oder Säulendegration.

Zwei weitere, nicht unwesentliche Aspekte der Dreifachdetektion, bestehen in Ihrer Flexibilität: Ist ein Detektor für die gewünschte Analyse nicht einsetzbar, so kann mit den verbleibenden Detektoren immer noch eine präzise Molekulargewichtsbestimmung durchgeführt werden. Außerdem führt der Vergleich verschiedener Methoden häufig zu einem besseren Verständnis der Polymerstruktur.

Copolymer-Analytik

Die Entwicklung und Synthese von immer spezielleren Polymeren und deren weitläufige Verwendung in industriellen und pharmazeutischen Anwendungen führt zu einer steigenden Komplexität in der Polymeranalytik. Die Verwendung von zwei oder mehr unterschiedlichen Monomeren führt zur Bildung von Copolymeren. Homogen aufgebaute statistische Copolymere können in der GPC wie Homopolymere behandelt werden. Für inhomogene Polymere mit über die Molekulargewichtsverteilung variierenden Anteilen der Monomere A und B ist dies nicht möglich.

full-screen

(2)

Durch den Einsatz von zwei Konzentrationsdetektoren (RI und UV), die unterschiedliche Antworten auf die Comonomere A und B liefern, ist die Berechnung des wahren Konzentrationsprofils und der Anteile von Monomer A und B möglich. In Gleichung (2) ist dieser Zusammenhang dargestellt. Dabei sind K_RI und K_UV gerätespezifische Konstanten, dn/dc ist das Brechungsindexinkrement und ε_λ der UV-Extinktionskoeffizient der Comonomere A und B.

Werden die beiden Konzentrationsdetektoren mit einem Viskositäts- und Lichtstreudetektor kombiniert, so sind genauso wie bei der Dreifachdetektion der Homopolymere die Verteilung sämtlicher polymerspezifischen Eigenschaften zugänglich.

Der gleiche Ansatz kann auch für die Analyse von Gemischen aus zwei Komponenten oder Polymerkomplexen wie zum Beispiel Protein/Polymer-Komplexen eingesetzt werden.

Polystyrol

Lineares Polystyrol (PS) ist sowohl mit enger als auch breiter Molekulargewichtsverteilung kommerziell verfügbar. Anhand von Polystyrol-Proben in Tetrahydrofuran können die Unterschiede in dem Ansprechverhalten der drei Detektoren beispielhaft deutlich gemacht werden.

full-screen

Abbildung 4: Dreifachchromatogramm von zwei eng verteilten Polystyrol-Standards.

In Abbildung 4 sind die Dreifachchromatogramme für eine Mischung von zwei eng verteilten Polystyrol-Standards (M_W = 850.000 und 30.000 g/mol) dargestellt. Das verwendete Säulensystem zeigt eine gute Auftrennung, so dass die Peaks vollständig getrennt sind. Das Chromatogramm des Brechungsindex-Detektors zeigt, dass das Polystyrol mit dem niedrigeren Molekulargewicht etwa viermal so konzentriert ist wie das hochmolekulare Polystyrol. Trotz dieses Konzentrationsunterschiedes sind die Signale des Viskositäts- und Lichtstreudetektors für das Polystyrol mit hohem Molekulargewicht wesentlich größer. Der Grund hierfür liegt in der Molekulargewichtsabhängigkeit der Viskositäts- und Lichtstreusignale.

Abbildung 5: Dreifachchromatogramm eines breit verteilten Polystyrols. Mw = 254.000 g/mol, PDI = 2,5, IV = 0,843 dL/g.

full-screen

Abbildung 5 zeigt das Dreifachchromatogramm einer polydispersen (breit verteilten) Polystyrol-Probe. Dabei ist zu erkennen, dass die Peaks der Lichtstreuung und des Viskosimeters verglichen mit dem RI-Chromatogramm zu hohen Molekulargewichten (kleinen Retentionsvolumina) hin verschoben sind. Diese Verschiebung beruht ausschließlich auf dem unterschiedlichen Ansprechverhalten der Detektoren. Der Versatz (Offset) der Chromatogramme, verursacht durch die Inter-Detektor-Volumina, wurde bereits durch die benutzte Software korrigiert. Während das Refraktometer-Signal unabhängig vom Molekulargewicht ist, reagieren Lichtstreu- und Viskositätsdetektor, wie beschrieben, wesentlich empfindlicher auf hohe Molekulargewichte, so dass Ihre Signale auf der linken Seite des Chromatogramms deutlich schneller ansteigen. Auf der rechten Seite des Chromatogramms fallen die Signale entsprechend schneller ab als das des RI-Detektors. Diese Verschiebung der Signale der molekulargewichtssensitiven Detektoren gegenüber dem RI-Signal ist auch ein Maß für die Polydispersität der Probe.

Bei genauem Vergleich der drei Kurven stellt man fest, dass die Verschiebung des Lichtstreu-Signals größer ist als die des Viskosimeter-Signals. Ursache hierfür ist, dass die intrinsische Viskosität nicht direkt proportional der Molekularmasse ist, sondern entsprechend der Mark-Houwink-Gleichung [η] = K · M^α ansteigt. Der Exponent a ist bei linearen Polymeren, welche in Lösung ein flexibles Knäuel bilden, kleiner als 1 (z.B. a ≈ 0,7 für PS in THF), so dass das Viskositäts-Signal mit dem Molekulargewicht langsamer wächst als das Signal des Lichtstreudetektors. Diesen Effekt sieht man auch bei den beiden eng verteilten Polystyrol-Proben in Abbildung 4.

Die logarithmische Kurve des Molekulargewichts über das Retentionsvolumen zeigt einen linearen Verlauf und somit ein ideales Trennverhalten nach dem Größenausschlussmechanismus an.

full-screen

Bromiertes Polystyrol

Die Leistungsfähigkeit der Dreifachdetektion zeigt sich deutlich beim Vergleich von Polystyrol (PS) zu bromiertem Polystyrol (BrPS, Einsatz als Flammschutzmittel) gleicher Kettenlänge. Bei der Bromierung wird Wasserstoff (1 amu) durch Brom (80 amu) ersetzt. Dabei kommt es zu einer Zunahme des Molekulargewichts, wobei sich die Größe des Polymerknäuels nur unwesentlich ändert. Schematisch ist dies in Abbildung 6 dargestellt.

Abbildung 6: Schematische Darstellung der Bromierung von Polystyrol.

full-screen

Vergleicht man die Chromatogramme des Polystyrols vor und nach der Bromierung (Abb. 7), so stellt man im RI-Chromatogramm nur eine minimale Veränderung fest. Mit der Methode der konventionellen Kalibrierung würde man daher auch nur eine minimale Massenänderung berechnen. Das Signal des Lichtstreudetektors hat jedoch eine deutlich höhere Intensität und zeigt so auch ein um den Faktor 2,5 höheres Molekulargewicht (Tab. 1) an. Die Abnahme des Viskositäts-Signals bestätigt als unabhängiger Detektor den Anstieg der Dichte des Polymers.

Abbildung 7: Vergleich der Detektorsignale für eine Polystyrolprobe vor und nach der Bromierung.

Tabelle 1: Molekulargewichte von Polystyrol vor und nach der Bromierung.

full-screen

Natürliche Makromoleküle - Maltodextrin

Maltodextrine werden durch enzymatischen Abbau von Stärke hergestellt. Sie finden als Nahrungsmittelzusatzstoffe zur Verbesserung der rheologischen Eigenschaften oder auch als Geschmacksverstärker Anwendung. Durch Unterschiede in der verwendeten Stärke, den eingesetzten Abbauenzymen oder der Prozessführung werden Maltodextrine erzeugt, die sich hinsichtlich Molekulargewicht und Verzweigungsstruktur stark unterscheiden.

Abbildung 8: Dreifachchromatogramm einer Maltodextrin-Probe. M_w = 468.000 g/mol, PDI = 3,48, IV = 0,117 dL/g.

Abbildung 8 zeigt das Dreifachchromatogramm einer Maltodextrin-Probe. Hier kann schon aus den Bandenformen die im hochmolekularen Bereich stark verzweigte Struktur dieser Probe abgelesen werden: die linke Seite der Bande besitzt ein intensives LALS-Signal, während das Viskositäts-Signal relativ klein ist. Mit anderen Worten: Ein hohes Molekulargewicht bei gleichzeitig niedriger intrinsischer Viskosität zeigt eine starke Verzweigung an.

full-screen

Abbildung 9: Mark-Houwink-Plot der Maltodextrin-Probe. Die gestrichelte Linie zeigt den Verlauf, wie man ihn für eine lineare Maltodextrinprobe erwarten würde, an.

Der mit dem Molekulargewicht zunehmende Verzweigungsgrad kann sehr deutlich im Mark-Houwink-Plot erkannt werden (Abb. 9). Bei linearen Polymerproben erhält man eine lineare Mark-Houwink-Auftragung, aus deren Steigung man Aussagen über die Kettenstruktur der Proben ableiten kann. Demgegenüber findet man für die Maltodextrin-Probe eine deutliche Abwärtskrümmung. Diese Krümmung zeigt an, dass die Probe bezüglich Ihrer Struktur nicht homogen ist, sondern dass im hochmolekularen Bereich zunehmend Seitenketten vorhanden sind. Die Anzahl der Seitenketten und die Verzweigungsfrequenz kann aus den vorliegenden Daten auch quantitativ ermittelt werden.

Weitere Beispiele für natürliche Makromoleküle, die erfolgreich mit der Gelpermeationschromatographie untersucht wurden, sind: Stärke, Cellulose, Nitrocellulose, Pektin, Xanthan, Heparin, Hyaluronsäure, Chitosan, Pullulan, Dextran, Careageenan, Proteine, Antikörper, RNA, DNA, ...

Zusammenfassung

Durch den Einsatz mehrerer Detektoren werden Informationsgehalt und Aussagekraft der Ergebnisse von GPC-Analysen gegenüber der konventionellen GPC wesentlich erhöht. Insbesondere zur Bestimmung von strukturellen Eigenschaften der Polymerproben bietet die Dreifachdetektion die optimale Lösung. Sie ermöglicht neben der Bestimmung der absoluten Molekulargewichte die Berechnung von Knäuelgrößen und Verzweigungsgraden, und es werden gleichzeitig physikalische Größen bestimmt, die ansonsten off-line mit zusätzlichen Apparaturen ermittelt werden müssten.

Die vielleicht größten Vorteile der Dreifachdetektion sind jedoch, dass keine aufwendige Erstellung von Kalibrationskurven notwendig ist und dass geringfügige Nichtidealitäten der Chromatographie wie z.B. Flussratenschwankungen, keine reine Größenausschlusstrennung oder Säulendegradation keinen Einfluss auf die Ergebnisse haben, da das Retentionsvolumen zur quantitativen Berechnung von Molekulargewichten, intrinsischen Viskositäten, Knäuelgrößen oder Verzweigungsgraden nicht herangezogen wird.

Die Analyse der Daten kann auf verschiedenen Ebenen erfolgen. Schon durch Betrachten des Dreifachchromatogrammes können qualitative Informationen über die in Frage stehende Polymerprobe gewonnen werden. Auf einfache Weise können mittlere physikalische Größen des Polymers ermittelt werden. Durch die Berechnung von Molekulargewichtsverteilungen und der Verteilung der intrinsischen Viskosität sind schließlich umfangreiche quantitative Aussagen über die Probe bis hin zu Verzweigungsgraden möglich.

Literatur

[1] M. A. Haney, Principles of Triple Detection GPC/SEC: The Deflection Refractometer (RI), Laboratory Equipment, March 2003.

[2] Z. Grubisic, P. Rempp, H. Benoit, A Universal Calibration for Gel Permeation Chromatography, J. Polym. Sci. B: Polym. Lett. 5, 753 (1967).

[3] M. A. Haney, The Differential Viscometer. II. On-line Viscosity Detector for Size-Exclusion Chromatography, J. Appl. Polym. Sci. 30, 3037 (1985).

[4] B. H. Zimm, W. H. Stockmayer, The Dimensions of Chain Molecules Containing Branches and Rings, J. Chem. Phys 17, 1301 (1949).

[5] S. Mori, H. G. Barth, Size Exclusion Chromatography, Kapitel 8.1, Springer Verlag Berlin (1999).