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CRISPR‐Cas

Zusammenfassung

CRISPR‐Cas ist ein adaptives und vererbbares Immunsystem, mit dem sich Prokaryoten gegen invasive genetische Elemente wie Viren wehren. Es eignet sich aber auch hervorragend zur Manipulation von Genomen. Die Nuklease Cas9 wird durch eine Leit‐RNA zu einem bestimmten DNA‐Abschnitt geführt und fügt dort einen Doppelstrangbruch ein. Dieser wird durch ein zelleigenes Reparatursystem verknüpft, wobei Fehler entstehen, die das Gen zerstören. In unserem Experiment wird ein Knockout des stabil in eine menschliche Glioblastomzelllinie eingefügten, viralen Thymidinsynthase‐Gens durchgeführt. Da letzteres mit dem Gen des Grün Fluoreszierenden Proteins fusioniert ist, lässt sich der Erfolg des Experiments an der abnehmenden grünen Fluoreszenz verfolgen. Gleichzeitig fluoreszieren Zellen, die Cas9 produzieren, orange‐rot, da Cas9 immer zusammen mit dem Orange Fluoreszierenden Protein produziert wird. Aus grün wird rot!

Summary

CRISPR‐Cas is an adaptive and heritable prokaryotic immune system which targets invasive genetic elements such as viruses and plasmids. In recent years it has been adapted for the site‐specific manipulation of eukaryotic genomes by deleting or exchanging gene copies. The nuclease Cas9 recognizes a given sequence within a host cell by a complementary guide‐RNA and inserts a double strand break which is repaired by the cell's own non‐homologous recombination repair. Due to this unprecise repair mechanism mistakes are inserted and the gene is disrupted. In our experiment we destruct the gene of a viral thymidine kinase stably inserted into the genome of a human glioblastoma cell line. As the thymidine kinase gene is fused to the gene of Green Fluorescent Protein, the success of the experiment can be monitored by a disappearance of the green fluorescence. At the same time cells producing Cas9 show an orange‐red fluorescence, because Cas9 is always produced together with the Orange Fluorescent Protein. Green will become red!

Das bakterielle Immunsystem CRISPR‐Cas eignet sich bestens zur zielgenauen Manipulation des Genoms eukaryotischer Zellen. Im Rahmen der Ausbildung oder des Studiums kann unser Experiment an diese noch junge Methode heranführen. Mit Hilfe der Nuklease Cas9 wird ein stabil ins Genom einer menschlichen Zelllinie eingebrachtes virales Gen ausgeschaltet. Dies kann anhand eines Markers fluoreszenzmikroskopisch verfolgt werden.

Autoren:   Larissa Tetsch, Hartmut Böhm, Markus Hartung
Journal:   Chemie in unserer Zeit
Jahrgang:   2017
Seiten:   n/a
DOI:   10.1002/ciuz.201700801
Erscheinungsdatum:   30.05.2017
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