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Simultane Untersuchung kinetischer, ortsspezifischer und struktureller Aspekte enzymatischer Proteinphosphorylierungen

Abstract

Die Phosphorylierung von Proteinen ist ein weit verbreiteter Prozess, welcher die mechanistische Grundlage für zelluläre Signalübertragung bildet. Derzeit werden Aspekte wie Ortsspezifität, Reaktionskinetik, der Einfluss von Kofaktoren und Struktur‐Funktions‐Beziehungen meist mit mehreren, untereinander nicht kompatiblen Methoden untersucht. Die hier vorgestellte Strategie vervielfacht die aus Protein‐ und Proteinkomplexphosphorylierungen ableitbaren Informationen und verlangt nur minimale Probenvorbereitung. Mithilfe hochauflösender nativer Massenspektrometrie verfolgen wir den konsekutiven Einbau von Phosphatgruppen in intakte Proteinkomplexe und lokalisieren deren Sequenzposition mittels Peptid‐LC‐MS/MS. Anhand von zwei Modellsystemen, der Kofaktor‐abhängigen Autophosphorylierung von Proteinkinase G sowie dem Zusammenwirken von Aurora‐Kinase A und Bora, sowohl als Enzym‐Substrat‐Paar als auch als stabiler Proteinkomplex, demonstrieren wir, wie verschiedene Gesichtspunkte des Phosphorylierungsprozesses simultan untersucht werden können.

Ganzheitliche Charakterisierung von Proteinphosphorylierungen: Der Phosphateinbau ist eine universelle Modifikation zellulärer Proteine mit vielfältigen funktionellen Auswirkungen. Die Kombination von nativer und „Bottom‐up“‐MS ermöglicht es, gleichzeitig nichtkovalente Proteinwechselwirkungen zu detektieren, phosphorylierte Aminosäuren zu identifizieren und, durch Grundlinienauflösung aller Phosphoisoformen, kinetische Daten zu erlangen.

Autoren:   Michiel van de Waterbeemd, Philip Lössl, Violette Gautier, Fabio Marino, Masami Yamashita, Elena Conti, Arjen Scholten, Albert J. R. Heck
Journal:   Angewandte Chemie
Band:   126
Ausgabe:   36
Jahrgang:   2014
Seiten:   9815
DOI:   10.1002/ange.201404637
Erscheinungsdatum:   09.07.2014
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