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Qualitätskontrolle von kolorimetrisch gefärbten Gelen und Blots

Zwei Methoden im Vergleich

Dipl.-Ing. Heiko Mixtacki, Biostep GmbH, Jahnsdorf

In der pharmazeutischen und Lebensmittelindustrie sind kolorimetrisch gefärbte Proben, z.B. Coomassie® gefärbte Gele, eine wichtige Methode in der Qualitätskontrolle. Die Aufnahme dieser Proben zu Dokumentations- und Quantifizierungszwecken kann prinzipiell auf zwei unterschiedlichen Arten erfolgen.

Neben herkömmlichen Kamerasystemen stehen alternativ auch Scannersysteme zur Verfügung. Beide haben ihre applikative Ausrichtung und somit ihre Vor- und Nachteile. Generell können alle kolorimetrisch gefärbten Gel-, Blot- und TLC-Proben mit einem scanner– bzw. kamerabasierten System problemlos detektiert werden. Beide Systeme nutzen CCDElemente für die Wandlung des einfallenden Lichtes in elektrische Signale. Aber an dieser Stelle hören die Gemeinsamkeiten auch schon auf. Die geometrische Form des CCD-Elementes und die adaptierte Optik sind bei Kamera- und Scannersystemen grundsätzlich verschieden. In Tabelle 1 werden die wichtigsten Parameter gegenübergestellt.

Technische Parameter Kamerasystem Scannersystem Bemerkung
Form des CCD-Chips Rechteck Zeile
Optik Zoomobjektiv kein Objektiv, ggf. Mikrolinsen
vor jedem CCD-Element
Auflösung abhängig von der Probengröße entsprechend dem eingestellten
dpi-Wert, konstant über die
ganze Aufnahmefläche
Vorteil für den Scanner
Geschwindigkeit mit einer Aufnahme wird die
gesamte Probe erfasst
mittels Schrittmotor wird die
CCD-Zeile in Abhängigkeit der
eingestellten Auflösung transportiert
Vorteil für die Kamera
Kalibrierbarkeit mit
Graustufenkeil
bedingt möglich ja entscheidender Vorteil
für den Scanner
Dynamikbereich 8 – 14 Bit 8 – 16 Bit
Belichtungszeit 0,04 s – 1 s für kolorimetrisch
gefärbte Proben
ca. 0,5 s pro Zeile
(ca. 1 min bei einer
Auflösung von 300 dpi
für ein Gel von 18 x 17 cm)
Vorteil für das Kamerasystem,
da es das Bild in einem
Vorgang aufnimmt
Applikation Fluoreszenz,
Chemilumineszenz,
kolorimetrisch gefärbte Proben
kolorimetrisch gefärbte Proben
Tabelle 1: Vergleich von Kamera- und Scannersystemen

Im Bereich fluoreszierender und lumineszierender Proben entfalten die kamerabasierten Systeme ihre größten Vorteile.

Für die Dokumentation von kolorimetrisch gefärbten Proben sind Kamera- und Scannersysteme geeignet. Bei der Quantifizierung dieser Gele hat aber der Scanner eindeutig die Nase vorn: durch die Möglichkeit der Kalibrierung mit einem Graustufenkeil, einem größeren Dynamikbereich bis 16 Bit und einer konstanten Auflösung bis zu 4800 dpi.

Abb 1: Scannersystem biostep ViewPix 900 für Transmissions-und Reflexionsaufnahmen.

Die Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für solch ein labortaugliches Scannersystem, welches auch für feuchte Proben (u.a. Gele) geeignet ist.

Neben den messtechnischen Aspekten spielen in der pharmazeutischen und in der Lebensmittelindustrie die GxP-konforme Datengenerierung und –verarbeitung eine wichtige Rolle. Dazu sind folgende Anforderungen zu erfüllen:

  • Methodenbasierte Steuerung der Aufnahmesysteme
  • Erfassung aller systemrelevanten Detektionsparameter zu jeder Probe
  • Hierarchisches Rechtesystem innerhalb der Benutzerverwaltung
  • Audit trail zur Dokumentation der Änderungen an den Bilddaten
  • Datenbankbasierte Archivierung inkl. Recherchefunktionen
  • Vollständige IQ/OQ-Qualifizierung des Gesamtsystems

Die biostep Steuer- und Dokumentationssoftware argusX1 bietet eine komfortable Lösung für diese Anforderungen. Die Ansteuerung der ViewPix-Scanner basiert auf individuellen, applikationsabhängigen Methoden, die nach SOP angelegt werden. Dieses Verfahren vereinfacht und automatisiert die Bedienung und garantiert eine hohe Reproduzierbarkeit. Die Aufnahmemethoden enthalten folgende wesentliche Faktoren:

  • Ansteuerung des Scanners im Durchlicht- (z.B. Gele) oder Auflichtmodus (z.B. Blots)
  • Aufnahme der Proben als 8, 16 Bit Graustufenbild oder 24, 48 Bit Farbbild
  • Einstellung von Helligkeit, Kontrast, Gamma
  • Selektion des Farbkanals (rot, grün, blau, benutzerdefiniert)
  • Ausrichtung des Bildes (Drehen, Spiegeln, Invertieren)
  • Analyse der Über- und Unterbelichtung

Abb. 2: Standard-Modus zur Scannersteuerung in argusX1.


Die Kalibrierung des Scanners für Graustufenaufnahmen ist ein sehr wichtiger Punkt für die GxP-Konformität. So werden u.a. altersbedingte Änderungen und die Unterschiede zwischen verschiedenen Systemen und applikationsabhängigen Einstellungen normiert. Wichtig für die tägliche Arbeit ist die Möglichkeit, verschiedene Kalibrierungen, die auf unterschiedlichen Graustufenkeilen basieren können, im System methodenabhängig zu verwalten. Denn z.B. bei Coomassie gefärbten Gelen sollte ein anderer Graustufenkeil zum Einsatz kommen als bei SilverStain gefärbten Gelen.


Abb. 3: Profi-Modus zur Scannersteuerung in argusX1 (Auswahl).

 

Die Speicherung der Kalibrierung in der Methode ist zeitlich gesehen ein temporärer Prozess. Spätestens bei der Neukalibrierung, die entsprechend der Festlegung in der SOP z.B. wöchentlich durchgeführt wird, wird die vorhandene Kalibrierung durch die neue ersetzt. Eine nachträgliche Einschätzung der Parameter (z.B. Anzahl der Kalibrierpunkte, max. Abweichung, Durchführender, Zeitpunkt der Kalibrierung), die über die Kalibierfunktion hinausgehen, wäre somit nicht mehr möglich. Um diesen Prozess lückenlos zu dokumentieren, muss die angewandte Kalibrierung mit allen Parametern zu jedem Probenbild gespeichert werden. In der Abbildung 4 ist ein entsprechendes Beispiel aufgeführt.


Abb. 4: Anzeige der vollständigen Kalibrierinformationen im kompletten Satz der Bilddaten zu einer in der Datenbank gespeicherten Probe.

In der biostep Steuer- und Dokumentationssoftware argusX1 werden zu jedem Probenbild die Informationen u.a. zum Scannertyp, zur Aufnahmemethode, zur Kalibrierung, zur Farboptimierung und zur Bearbeitungshistorie gespeichert. Mit diesen detaillierten Daten kann eine nachträgliche GxP-konforme Beurteilung der Aufnahmesituation erfolgen.

Der eigentliche Sinn der Kalibrierung wird aber erst in der Auswertesoftware realisiert. Die von argusX1 zu jeder Aufnahme gespeicherte Kalibrierung wird mit dem Bild direkt zur Auswertesoftware für Elektrophoresegele Gelix One übertragen. Die Berechnung der Lane- und Bandeninformationen in der 1D-Software basiert in Anwendung der Kalibrierung auf OD-Werten.

Abb. 5: Auswertesoftware Gelix One für 1D-Elektrophoresegele.

 

Zusammenfassung


In der pharmazeutischen und Lebensmittelindustrie ist der Einsatz von Scannersystemen zur Aufnahme, Dokumentation und Auswertung von kolorimetrisch gefärbten Gelen, Blots und TLC-Proben gegenüber herkömmlichen Kamerasystemen zu empfehlen. Entscheidend für die vollständige Erfüllung von GxP-Richtlinien ist eine Kombination aus Scanner und geeigneter Steuer- sowie Auswertesoftware.

 

 

Im Text aufgeführte Warenzeichen

  • Coomassie ist ein eingetragenes Warenzeichen der Imperial Industries PLC
  • argusX1, biostep, Gelix One sind eingetragene Warenzeichen der biostep GmbH

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