Dieser Artikel stellt eine Studie vor, die die Vorteile von FFF-MALS-DLS für die Charakterisierung von Nanolipidpartikeln demonstriert. mehr
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Der Marktanteil von biotechnologisch hergestellten Arzneimitteln betrug 2010 ca. 20% des Pharmamarktes in Deutschland, wobei monoklonale Antikörper den größten Anteil ausmachten[1]. Die Formulierungsentwicklung ist einer der kritischen Schritte beim Einsatz von Biopharmazeutika als therapeutische Produkte. Ziel der Formulierung ist die Stabilisierung der Proteine bzw. Protein-Komplexe und ihrer oft hochempfindlichen 3-D Struktur durch die Entwicklung eines geeigneten Formulierungspuffers.
Die Formulierung muss beständig gegenüber physikalischen und chemischen Einflüssen sein. Typische Probleme bei Proteinen in ihrer Darreichungsform sind kovalente und nicht-kovalente Aggregation, Desaminierung, Spaltung, Oxidation sowie Oberflächendenaturierung. Im Zuge der Entwicklung einer erfolgreichen Formulierung wird die Auswirkung verschiedener Hilfsstoffe wie Zucker, Salze, Antioxidationsmittel, Aminosäuren und Detergenzien auf die Stabilität des Produktes optimiert. Da die Kombinationen verschiedener Additive in unterschiedlichen Konzentrationen und Puffern mit verschiedenen pH-Werten untersucht werden, entstehen umfangreiche Testreihen.
Die Routinemethode für Charakterisierung und Quantifizierung von Proteinaggregaten im Rahmen von Formulierungsstudien ist die Größenausschlusschromatographie (SEC/GPC). Die Größenausschlusschromatographie wird oft mit Mehrwinkel-Lichtstreudetektoren (MALS) gekoppelt, um die Molekülmassen der eluierenden Komponenten absolut zu messen und so Robustheit und Informationsgehalt der Experimente zu optimieren. Die Hauptnachteile der Größenausschlusschromatographie liegen jedoch in der Veränderung der Aggregate durch Verdünnung, Scherung und Interaktion mit der stationären Phase. Auch die Zeit, erforderlich pro Messung und für die Gleichgewichtseinstellung nach Wechsel der mobilen Phase, ist bei der Verwendung der Größenausschlusschromatographie für ein Screening vieler Proteinlösungen problematisch.
Deshalb werden diese Studien immer öfter mit säulenfreien Methoden wie Asymmetrischer Feldflussfraktionierung (AF4) [2], Hohlfaser Feldflussfraktionierung (HF5) [3] und Dynamischer Lichtstreuung (DLS) durchgeführt. Dynamische Lichtstreuung bietet im Vergleich zu anderen Methoden die Möglichkeit, Messungen automatisiert und sehr schnell in einem Well-Plate durchzuführen und ist daher im Verhältnis der vorgenannten Methoden „High-Throughput“ fähig. Des Weiteren wird die Probe nicht verdünnt und keinen Scherkräften ausgesetzt, was eine mögliche Veränderung durch diese Effekte verhindert.
In dieser Publikation wird die Bestimmung von Parametern, die für die Formulierung von Bedeutung sind, mittels DLS vorgestellt. Dabei handelt es sich um die Viskosität, die Aggregation, die Löslichkeit sowie die Dissoziationskonstante. Neu ist, dass diese Parameter automatisiert mit wenig Bedarf an Probe und Zeit mittels einfacher DLS-Messungen bestimmt werden können.
Streulicht wird von einem Molekül emittiert, wenn in ihm durch das elektrische Feld des Lichtes ein Dipol induziert wird und wieder relaxiert. Grundsätzlich unterscheidet man zwei Methoden von Streulichtmessungen: Mehrwinkel-Lichtstreuung (MALS) [4] und Dynamische Lichtstreuung (DLS) [5].
MALS Detektoren messen die Intensität des gestreuten Lichtes eines Moleküls bei verschiedenen Streuwinkeln. Durch Extrapolation auf den Streuwinkel 0° werden absolute Molekülmasse und Gyrationsradius des Moleküls bestimmt. Die Molekülmasse wird beim Streuwinkel Null bestimmt, da eine Winkelabhängigkeit, verursacht durch Interferenz, für die Menge des gestreuten Lichtes gegeben ist. Wird der Lichtstreudetektor in ein chromatographisches System integriert, werden die Molekülmasse der Fraktionen und auch die Molekülmassen- und Radien-Verteilungen absolut bestimmt, d.h. es werden keine Annahmen über die Gestalt des Makromoleküls vorausgesetzt
Werden die MALS Messungen an einer Verdünnungsreihe durchgeführt, kann neben mittlerer Molekülmasse und mittlerem Radius auch der zweite Virial-Koeffizient (A2) gemessen werden. Der zweite Virial-Koeffizient ist ein Maß für die Löslichkeit des Proteins in Lösung. Er beschreibt die Wechselwirkungen der Proteinmoleküle miteinander und mit dem Lösungsmittel. Die Löslichkeit ist ein wichtiger Parameter bei den Formulierungsstudien.
DLS Detektoren messen die zeitabhängige Fluktuation der Streulichtintensität, die durch die Brownsche Molekularbewegung verursacht wird (Abbildung 1). Große Moleküle bewegen sich langsamer durch die Lösung als kleine. Durch die Messung der Fluktuationsänderung (Abbildung 2) kann die Diffusionskonstante und mit Hilfe der Stokes-Einstein-Beziehung die Teilchengröße gemessen werden.
Die Messung der Streulichtmenge wird mit einer sogenannten Avalanche-Photodiode durchgeführt. Diese Diode stellt die für die Dynamische Lichtstreuung erforderliche hohe zeitliche Auflösung von einigen 100 ns zur Verfügung. Die Auswertung erfolgt in dem Autokorrelator, einem Prozessor, der die zeitliche Änderung der Streulichtmenge auswertet. Je größer das Molekül, d.h. je langsamer es diffundiert, desto später tritt das Signal in der Autokorrelationsfunktion (Abbildung 3) auf.
Abbildung 3: Autokorrelationsfunktion von BSA (Radius =3.6 nm) und Polystyrol Nanosphere Größenstandard 100 (Radius 50 nm).
Der Parameter, der mittels DLS gemessen wird, ist der Diffusionskoeffizient (D), aus dem der hydrodynamische Radius (Rh) unter Verwendung der Stokes-Einstein Gleichung berechnet wird:
Der hydrodynamische Radius Rh ist der Radius einer Kugel, die den gleichen Diffusionskoeffizienten wie das gemessene Protein aufweist. Daher wird der hydrodynamische Radius auch als Kugeläquivalent-Radius bezeichnet.
Die Detektionsgrenzen des hydrodynamischen Radius liegen zwischen 0.3 nm und 1 µm, wobei die untere Grenze durch die im Puffer verwendeten Salze gegeben ist. Die obere Grenze ergibt sich aus der Gravität. Weil die Intensität des Streulichtes proportional zur Molekülmasse ist, ist die Methode hoch empfindlich bei der Detektion kleiner Mengen großer Aggregate.
Moderne Proteinpräparate sind hoch konzentriert und enthalten bis zu 200 mg/mL Protein.[6] Dies bedeutet besondere Herausforderungen für die Analysemethode, da die hohe Konzentration die Viskosität erhöht. Die Viskosität der Proteinlösung muss bekannt sein, um den hydrodynamischen Radius zu bestimmen. Automatisierte DLS ist ein Verfahren, dass die Viskosität dieser Lösungen mittels „tracer particles“ bestimmen kann. Dieses Verfahren wird im Folgenden vorgestellt.
In der Publikation von Lehermayr et al.[7] wurde gezeigt, dass mittels Radien-Messung mit automatisierter DLS auch die Dissoziationskonstante kD, und der zweite Virial-Koeffizienten A2 der Formulierung messbar sind. Die Vorteile der Bestimmung dieser Parameter mittels automatisierter DLS liegen im hohen Automatisierunggrad, der Geschwindigkeit und der niedrigen benötigten Substanzmenge.
Für die hier vorgestellten Messungen wurde der Wyatt DynaPro Plate Reader eingesetzt. Gemessen wurde in einem 384 Well-Plate. Hierbei handelt es sich um eine industrielle Standardplatte für Plate Reader mit optischen Messmethoden, in der mit einem Volumen von 20 µL pro Kavität gearbeitet wurde. Verwendbar sind ebenfalls Well-Plates mit 96 oder 1536 Kavitäten, Standardplatten ebenso wie Low-Volume Well-Plates. Die Kavitäten werden nur einmal gefüllt, so dass keine Verschleppung (Cross-Contamination) von Probe auftreten kann.
Abbildung 4: Größenverteilung der Polystyrolpartikel in 3, 6 und 9 mg/mL Antikörperlösung.
Bei der hier vorgestellten Probe handelt es sich um einen monoklonalen Antikörper, die Messungen wurden mit Konzentrationen von 3 bis 10 mg/mL durchgeführt. Als „tracer particles“ für die Messung der Viskosität wurden Polystyrolpartikel mit 50 nm Radius verwendet. Da direkt in dem Well-Plate gemessen wird, muss die Probe nicht während des Messvorgangs transportiert werden. Es ist kein Spülen oder Reinigen von Kapillaren und Küvetten erforderlich. Daher entfallen Wartezeiten, die wegen Reinigungen und manuellem Beschicken von Küvetten auftreten. Durch die so gewonnene Zeit ist es möglich, mehr Proben, die gleiche Probe mehrmals oder auch den reinen Puffer zu messen.
Messungen der reinen Polystyrolpartikel ergeben einen hydrodynamischen Radius (Rh) von 50 nm (Abbildung 4). Bei der Messung der Proteinlösungen erhält man durch den Einfluss der Viskosität der verschiedenen Proteinkonzentrationen Teilchengrößen von 50 bis 63 nm. Aus dem Verhältnis zwischen der erwarteten Teilchengröße und der gemessenen Größe kann somit die tatsächliche Viskosität aus der Stokes-Einstein-Beziehung errechnet werden:
Misst man den hydrodynamischen Radius der reinen Antikörperverdünnungsreihe, so kann man für jede Konzentration die jeweilige Viskosität einsetzen und erhält so die Werte für den hydrodynamischen Radius (Abbildung 5).
Yadav et al.[8] zeigen, dass man aus der Konzentrationsabhängigkeit des hydrodynamischen Radius die Dissoziationskonstante des Proteins messen kann:
Hierbei ist Dm der gemessene Diffusionskoeffizient bei verschiedenen Konzentrationen und Ds ist der Diffusionskoeffizient der Probe bei der Konzentration C = 0 mg/ml.
Aus der Steigung (‑2.39*10-8 m2/s) ergibt sich eine Dissoziationskonstante kD von (‑0.35 mL/g). Aus dieser lässt sich nach Lehermayer et al. aus folgender Formel der zweite Virialkoeffizient A2 bestimmen:
Hierbei ist Mw die molare Masse des gemessenen Protein-Monomers. Es ergibt sich somit ein A2 von (5.58e-5 mol mL/g2) für den gemessenen Antikörper.
Zusammenfassung |
Dynamische Lichtstreuung ist eine schnelle Charakterisierungsmethode, die Größenverteilungen ohne chromatographische Trennung und ohne Verdünnung misst. Die Messung findet direkt in einem Well-Plate statt, die Probe braucht während der Messung nicht transportiert zu werden. Dadurch ist die Charakterisierung von Proben mit konzentrationsabhängiger, reversibler Aggregation möglich. Dies gilt insbesondere für monoklonale Antikörper mit reversibler Selbstassoziation.
Direkte Messungen für die Viskosität und Messmethoden für die Messung des zweiten Virial-Koeffizienten bedeuteten bisher immer einen hohen Einsatz von Probe und Zeit. Mit der vorgestellten automatisierten Methode ist es möglich, die Messungen in Well-Plates in einer Zeit unter einer Stunde inklusive Pipettieren bei den acht gezeigten Konzentrationen durchzuführen. Hierzu wurden weniger als 100 µL der Antikörperstammlösung von 100 mg/mL verwendet. Dies ist deutlich weniger Probe als die Menge, die bisher mit traditionellen Messverfahren für die Bestimmung von Viskosität, Aggregation, Löslichkeit und Dissoziationskonstante erforderlich war. Die Messung kann auch in einem 1536 Well-Plate durchgeführt werden. Hierbei kann das Probenvolumen auf eine Minimalmenge von 1.5 µl je Kavitäten und damit um ungefähr den Faktor 30 reduziert werden.
Literatur:
Dieser Artikel stellt eine Studie vor, die die Vorteile von FFF-MALS-DLS für die Charakterisierung von Nanolipidpartikeln demonstriert. mehr
Der Diffusionsinteraktionsparameter (kD) als Indikator für kolloidale und thermische Stabilität
Das hier gezeigte Experiment verdeutlicht, wie thermische und kolloidale Stabilität gleichzeitig gemessen werden können mehr
Proteinformulierung im „High-Throughput“
Der Marktanteil von biotechnologisch hergestellten Arzneimitteln betrug 2010 ca. 20% des Pharmamarktes in Deutschland, wobei monoklonale Antikörper den größten Anteil ausmachten. Die Formulierungsentwicklung ist einer der kritischen Schritte beim Ein mehr
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