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GPC/SEC mit Dreifachdetektion und Photodiodenarray-Technologie: maximaler Informationsgehalt in kompaktem Format

G. Heinzmann, B. Tartsch
Viscotek, a Malvern Company
Carl-Zeiss-Str. 11, D-68753 Waghäusel, Germany

Die Technologie der Gelpermeationschromatographie (GPC/SEC) mit Dreifachdetektion (Lichtstreuung, Viskositätsdetektion und Brechungsindexdetektion) ist im Bereich der Polymer-, Biopolymer und Proteinanalytik mittlerweile eine etablierte Technik die aufgrund des deutlich höheren Informationsgehaltes mehr und mehr einfache GPC/SEC-Systeme mit reiner Konzentrationsdetektion ersetzt. Oft wird bei diesen Systemen noch ein UV-Detektor hinzugenommen der vor allem im Bereich der Copolymer- und Konjugatanalyse wichtige Informationen über die Zusammensetzung der Proben liefern kann. Man spricht dann auch oft von Tetradetektionssystemen. Die neueste Entwicklung in diesem Bereich ist die Ausweitung der UV-Detektion auf eine Photodiodenarraydetektion (PDA) mit der nicht nur einzelne UV-Wellenlängen sondern komplette spektrale Informationen an jedem Punkt des Chromatogramms erhalten werden können. Damit steigt der Informationsgehalt eines einzigen GPC/SECExperiments noch weiter an. Die neue Dreifachdetektions-GPC/SEC Technologie mit PDA-Detektion wird anhand eines Beispiels erläutert.

Einleitung

Während im Bereich der HPLC-Anwendungen die Photodiodenarray-Technologie schon seit längerer Zeit zur Standardausrüstung gehört hat sich diese im Bereich der GPC/SEC bislang nur in wenigen Applikationen als hilfreich erwiesen. Viele klassische Polymere wie z. B. Polyethylen oder Polymethylmethacrylat (PMMA) enthalten keine chromophoren Gruppen und sind daher nahezu überhaupt nicht UV-aktiv. Betrachtet man den großen Bereich der Biopolymere so findet man hier deutlich mehr Anwendungen für die UV-Detektion. Zwar sind viele Bio-Polysaccharide ebenfalls nahezu UV-inaktiv, allerdings sind bei diesen Substanzen oft Modifikationen mit Proteinen vorhanden (z. B. Gummi Arabicum) die dann eine UV-Detektion bei 280 nm, dem Absorptionsmaximum der meisten Proteine, möglich machen. Besonders interessant wird die UV- bzw. PDA-Detektion im Bereich der Drug Delivery Anwendungen bei Konjugaten wie pegylierten oder hesylierten Proteinen. Hier kann man mit dieser Technologie exakt den Anteil an Protein und PEG (Polyethylenglykol) bzw. HES (Hydroxyethylstärke) im Komplex bestimmen.

Abb.1: Integrierter GPC/SEC-Detektor mit Dreifachdetektion und Photodiodenarray-Technologie


Das GPC/SEC-System mit Dreifachdetektion und Photodiodenarray-Technologie

Moderne und leistungsfähige GPC/SEC-System mit Dreifachdetektion zeichnen sich durch eine integrierte Bauweise aus. Dadurch wird gewährleistet dass alle Detektoren und ggf. auch die Trennsäulen im selben Temperaturfeld sind und die Verbindungen zwischen den Detektoren so klein wie möglich gehalten werden um unnötiges Totvolumen und dadurch erzeugte Peakverbreiterung zu vermeiden. In Abb.1 ist ein integrierter GPC/SEC-Detektor mit Dreifachdetektion und Photodiodenarray-Technologie abgebildet.

Im Fall des PDA-Detektors handelt es sich im einfachsten und kostengünstigsten Fall um einen Detektor mit einem Array aus 256 Dioden, für spezielle Anwendungen die eine sehr feine Auflösung des zu untersuchenden Wellenlängenbereichs benötigen kann aber auch ein Array von bis zu 1024 Dioden verwendet werden.

Abb. 2: Chromatogramm eines breit verteilten Polysytrolstandard mit allen vier Detektoren: Lichtstreuung (schwarz), Viskositätsdetektor (blau), Brechungsindexdetektor (rot) und eine Wellenlänge des UV-PDA-Detektors (magenta; λ = 254 nm)


Applikationsbeispiel für die GPC/SEC mit Dreifachdetektion und Photodiodenarray-Technologie

Die Leistungsfähigkeit der GPC/SEC mit Dreifachdetektion und Photodiodenarray-Technologie kann zunächst anhand der Messung eines breit verteilten Polysytrolstandards mit einem Molekulargewicht (Mw) von 250.000 D und einer Polydispersität von 2,5 dargestellt werden. Abb. 2 zeigt das Chromatogramm aller vier Detektoren: Lichtstreuung,
Viskositätsdetektor, Brechungsindexdetektor und eine Wellenlänge des UV-Detektors (254 nm).

Abb. 3: Gesamtansicht der OmniSECTM-Software zur Verarbeitung von spektralen Informationen aus einem PDA-Detektor


Wechselt man in der OmniSECTM-Software nun in den spektralen Modus so erhält man zunächst einen Überblick über die verfügbaren spektralen Informationen über dem Verlauf des Elutionsvolumens (Abb. 3). Nun können aus der Summe der spektralen Informationen eine, zwei oder auch mehrere Wellenlängen über ein einfaches Auswahlmenü extrahiert und überlagert dargestellt werden (Abb. 4).

Abb. 4: Extraktion und Überlagerung von zwei UV-Wellenlängen (259,2 nm (magenta) und 263,3 nm (rot))


Die dreidimensionale spektrale Abbildung in der OmniSECTM-Software kann in allen drei Raumrichtungen gedreht werden um jede beliebige Ansicht der spektralen Information darstellen zu können (Abb. 5)

Abb. 5: Frei drehbare dreidimensionale spektrale Abbildung in der OmniSECTM-Software


Der Photodiodenarray-Detektor kann in jedes Viscotek-GPC/SEC-System integriert werden, unabhängig davon ob es sich um ein voll integriertes System mit dem TDA-Detektor handelt oder einem modularen System mit einen Dualdetektor Modell 270. Die Software für die Verarbeitung der spektralen Informationen ist direkt in der OmniSECTM-Software integriert.

Zusammenfassung

Mit der Einführung der Photodiodenarray(PDA)-Technologie in die Technik der GPC/SEC mit Dreifachdetektion kann der Informationsgehalt der aus einem einzigen GPC/SEC-Experiment erhalten werden kann nochmals deutlich gesteigert werden. Der PDA-Detektor kann in jedes GPC/SEC-System von Viscotek integriert werden. Zusammen mit der bedienerfreundlichen und umfangreichen OmniSECTM-Software ist das Dreifach-detektionssystem mit PDA-Detektor von Viscotek das derzeit leistungsfähigste am Markt verfügbare GPC/SEC-System.

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