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Cre/loxP-System



Das Cre/loxP-System ist ein in den frühen 1990er Jahren entwickeltes Rekombinations-System, das ursprünglich aus dem Bakteriophagen P1 stammt und mit dem DNA-Sequenzen gezielt entfernt oder rekomibiniert werden können. Es wird beispielsweise dazu verwendet, gezielt Markergene aus transgenen Pflanzen zu eliminieren. So ist es möglich, transgene Organismen zu erzeugen, ohne dass anschließend eine Selektion auf Grundlage von Herbizid- oder Antibiotikaresistenzen notwendig wird.

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Mit loxP wird eine bestimmte Basensequenz der DNA bezeichnet, welche als Erkennungssequenz für die Rekombinase (ein Enzym) cre fungiert. Möchte man aus einem DNA-Strang eine bestimmte DNA-Sequenz bzw. ein bestimmtes Gen entfernen, setzt man gezielt vor und hinter diesen DNA-Abschnitt eine loxP-Stelle. Das cre-Enzym erkennt und bindet die jeweiligen loxP-Stellen und schneidet die entsprechende DNA-Sequenz bzw. das Gen heraus. Die beiden verbleibenden loxP-Enden werden zusammengefügt. Damit ist das Marker-Gen eliminiert.

Hierzu muss zunächst cre-Rekombinase vorübergehend (transient) in die Zelle übertragen werden. Diese Übertragung kann sowohl mit Hilfe eines Pflanzenvirus (PVX, TMV) als auch durch Agrobacterium tumefaciens erfolgen. Alternativ kann man auch zwei transgene Tierstämme erzeugen (einen mit loxP-Sequenzen und einen mit cre-Rekombinase). Dabei stellt man die cre-Rekombinase unter einen Promotor, welcher z.B. durch Schwermetalle aktiviert wird. Anschließend kreuzt man beide, wodurch man Tiere enthält, welche beide Transgene enthalten. Will man nun das durch loxP-Sequenzen markierte DNA-Stück herausschneiden, so braucht man den Tieren nur ein Schwermetall füttern. Dadurch wird der Promotor der cre-Rekombinase aktiv und diese exprimiert. Diese scheidet dann das DNA-Stück aus und man kann den daraus resultierenden Effekt beobachten.

Die Veränderung wird mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Southern-Blot bestätigt. Die durch die Rekombinase cre ausgelösten Rekombinationsereignisse können auf die nächste Generation über Regeneration oder Selbstbestäubung übertragen werden. Die Nachkommen aus der Selbstbestäubung sind dann, wenn alle Reaktionsschritte erfolgreich verlaufen sind, markerfrei, tragen aber das interessierende Gen.

Weitere Einsatzmöglichkeit des Cre-loxP Systems: Erstellung gewebespezifischer und/oder induzierbarer "Knockouts" (Transgene Tiere).

 
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