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Fluoreszenzlebensdauer



Die Fluoreszenzlebensdauer gibt die mittlere Zeit an, die ein Molekül in einem angeregten Zustand bleibt, bevor es ein Photon emittiert und damit in den Grundzustand zurückkehrt. Der Zerfall der Fluoreszenz folgt dabei einem exponentiellen Gesetz:

I(t)=I_0 \exp \left(-\frac{t}{\tau}\right).

Weiteres empfehlenswertes Fachwissen

Hierbei ist I0 die Fluoreszenzintensität unmittelbar nach einem Anregungsblitz (z.B. ein Laserpuls), t die Zeit und τ die Fluoreszenzlebensdauer. Für diese gilt

\frac{1}{\tau}=k_r+k_{nr}.

Das bedeutet es existieren strahlende Prozesse, die mit der Rate kr zerfallen und nicht-strahlende Prozesse, die mit der Rate knr zerfallen. Bei stark fluoreszierenden Stoffen, wie Fluoreszenzfarbstoffen, ist knr verschwindent gering. Bei nicht-fluoreszierenden Stoffen (also den meisten Dingen unserer Umgebung) ist hingegen kr viel kleiner als knr.

Typische Fluoreszenzlebensdauern liegen im Bereich von wenigen Nanosekunden. Dabei ist zu beachten, dass es sich hier um einen spinerlaubten Vorgang (Fluoreszenz) handelt. Beim spinverbotenen Vorgang (Phosphoreszenz) ergeben sich um Größenordnungen längere Lebenszeiten im Bereich von Millisekunden bis Stunden.

Die Fluoreszenzlebensdauer ist in der Spektroskopie und Mikroskopie ein wichtiger Messparameter, der zur Unterscheidung verschiedener (auch gleichfarbiger) Fluorophore dient oder die Anwesenheit von Molekülen (Akzeptoren) verrät, indem ein Energietransfer vom Fluorophor (Donor) zum Akzeptormolekül stattfindet und damit die Fluoreszenzlebensdauer des Donors verringert (FRET: Fluorescence resonance energy transfer oder auch Förster resonance energy transfer).

Zum Beispiel wird in einer Zelle die Fluoreszenzlebensdauer durch die nähere Umgebung des Fluorophors beeinflusst, d.h. die Fluorophore können als Messsonden der Umgebung dienen.

Experimentelle Bestimmung

 

Die Ermittlung von Fluoreszenzlebensdauern erfordert die zeitaufgelöste Aufzeichnung der Intensität emittierter Strahlung. Ein gängiges Verfahren dafür ist die zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (TCSPC). Dabei erfolgt die Anregung der Probe periodisch mit monochromatischen Lichtblitzen geringer Intensität (LASER, Nanosekunden-Blitzlampe). Die Detektion der Fluoreszenz erfolgt bei einer größeren, als der zur Anregung verwendeten, Wellenlänge (Monochromator auf Emissionsseite der Versuchsanordnung) mit einem Sekundärelektronenvervielfacher (Photomultiplier, PMT), der in der Lage ist, einzelne Photonen zu registrieren.

Wird das Licht der Anregungslichtquelle so stark abgeschwächt, dass nur noch nach ein bis fünf Prozent der Lichtblitze ein Signal registriert wird, so kann davon ausgegangen werden, dass es sich um die Registrierung einzelner Photonen handelt. Mit einer elektronischen Schaltung werden Zeitmessungen durchgeführt, die von einem zusätzlichen Detektor (Photodiode) direkt an der Lichtquelle gestartet und vom Signal des Fluoreszenzdetektors gestoppt werden. Durch die Diskretisierung des Zeitsignals erhält man nach Durchlaufen vieler Anregungs-/Messzyklen ein (von der Auflösung der eingesetzten Analog-Digital-Wandler abhängiges) Histogramm, dessen Einhüllende dem Signal einer analogen Aufzeichnung des zeitaufgelösten Intensitätsverlaufs der Fluoreszenz nach einem einzelnen Anregungspuls hoher Leistung entspricht.

Aus dem dabei erhaltenen Histogramm (siehe Abbildung) kann auf graphischem Wege oder durch Regressionsanalyse die Fluoreszenzlebensdauer τ ermittelt werden.

Eine andere Methode ist die Messung in der Frequenzdomäne (Phasenfluorometrie). Hierbei wird die Probe mit einem intensitätsmodulierten Licht E(t) der Frequenz ω auf die Probe eingestrahlt. Detektiert wird das emittierte Fluoreszenzlicht F(t), das mit der gleichen Frequenz moduliert ist. Allerdings wird die Modulationsamplitude verringert und es tritt eine Phasenverschiebung auf. Das System wird wie folgt beschrieben (lineare Antwort):

F \left( t \right) = \chi \left( \omega \right) E \left( t \right) = \left| \chi \left( \omega \right) \right|\ E_0\ \mathrm{e}^{\left( -i \left( \omega t - \phi \left( \omega \right) \right) \right)}

\chi \left(\omega\right) ist die Suszeptibilität, die sich aus einem Dispersionsterm und einem Absorptionsterm zusammensetzt. Wird nun als Zeitantwort auf eine Delta-Störung eine Debye-Relaxation angenommen:

\overline{\chi}\left(t\right) = \mathrm{e}^{-\frac{t}{\tau_M}},

dann folgt für die Frequenzdomäne (Fouriertransformation):

\chi\left(\omega\right)=\frac{1+i \omega \; \tau_M}{1+{\omega}^2 \; {\tau_M}^2}

Für Phase und Demodulation M ergibt sich dann:

\phi\left(\omega\right)=\arctan{\left(\omega\;\tau_P\right)}
M=\left|\chi\left(\omega\right)\right|=\sqrt{\frac{1}{1+{\omega}^2\;{\tau_M}^2}}

Dabei sind τP und τM die Abklingzeiten für die Phase bzw. die Demodulation. Im Falle nur eines Fluorophors sind diese gleich und frequenzunabhängig.

Literatur

  • Joseph R. Lakowicz: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Plenum Publishing Corporation, 2. Ausgabe, 1999
  • K. Suhling et al. - Imaging the Environment of Green Fluorescent Protein, Biophysical Journal (2002) 83, 3589-3595
  • Primer on Time-Correlated Single Photon Counting, PicoQuant GmbH, Berlin.
 
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